Посилена щільність лімфатичних судин, ремоделювання та запалення відображаються експресією генів

Анотація

Частота діабету 2 типу та ожиріння швидко зростає у всьому світі (1). В даний час генералізована нечутливість до інсуліну вважається центральною патогенною подією (2), яка часто пов'язана із системним метаболічним синдромом, станом хронічного запалення низького рівня, що включає активацію макрофагів у жировій тканині (3). Недавня інформація також вказує на генетичні фактори розвитку хвороби (4). Однак хронічна гіперглікемія викликає значні макро- та мікросудинні зміни (5), що призводять до системного ураження органів. Великі судини реагують на хронічно підвищений рівень глюкози та метаболітів, що зумовлюються глюкозою, з посиленим атеросклерозом. Діабетична мікроангіопатія поступово викликає ретинопатію, що призводить до подальшої сліпоти та нефропатії, найчастішої причини ниркової недостатності. У шкірі мікроваскулопатія викликає тривале запалення, порушення загоєння ран та виразок (6).

лімфатичних

У цій статті ми повідомляємо про посилену щільність лімфатичних мікросудин у шкірі хворих на цукровий діабет 2 типу. Порівнюючи профілі експресії генів свіжоізольованих шкірних лімфатичних ендотеліальних клітин (ЛЕК) у пацієнтів з діабетом 2 типу з тими, що мають нормоглікемічний контроль, ми виявили молекулярні та клітинні процеси, що регулюються в лімфатичних судинах, зокрема, провоспалювальні, лімфангіогенні та посилені ліпідні човники властивості, що супроводжуються регульованим імунним захистом, медіаторами апоптозу та малими транспортерами з’єднань. Одночасно ми простежили сильну шкірну інфільтрацію CD68 + макрофагів, яка спричинила підвищений рівень фактора некрозу пухлини-α (TNF-α). Підгрупа нерегульованих генів діабетичного LEC (dLEC) реагувала на TNF-α і корелювала з ремоделюванням та запаленням лімфатичних судин, включаючи хемокін CXCL10, що особливо призвело до приваблення макрофагів та прилипання до LEC in vitro. Таким чином, ми отримали перші вказівки на нашу думку про те, що шкірна лімфатична система бере активну участь у прогресуванні шкірних проявів при цукровому діабеті 2 типу.

ДИЗАЙН ДИЗАЙН І МЕТОДИ

Зразки шкіри хворих на цукровий діабет та недіабетики 2 типу.

Дослідження було схвалено місцевим комітетом з етики (пропозиція № 449/2001; 81/2008), і всі пацієнти (описані в додатковій таблиці 1) дали інформовану згоду. Зразки шкіри (n = 4 у кожній групі) брали з проксимального відділу ампутованих ніг або черевної порожнини тканини, а також дбали про ділянки посіву на максимальній відстані від запальних або виразкових змін (~ 15 см).

Імуногістохімічні аналізи.

Імуногістохімічне фарбування вбудованих у парафін або кріофіксованих ділянок шкіри проводили, як описано раніше (10). Додаткова таблиця 2 узагальнює антитіла та відповідні розведення, що застосовуються. Для кількісних оцінок, за винятком порожніх ділянок, мікроскопічні мікроскопи Olympus VANOX AHBT3 були захоплені неперекриваючимися мікроскопічними полями (області, що представляють інтерес (ROI)) 100 мкм 2 (30 полів на пацієнта). Позитивно забарвлені судини, клітинні ядра та макрофаги були підраховані в цих ROI, і вимірювали розмір поперечного перерізу (називають діаметром) судин. Середні цифри були розраховані на групу пацієнтів та статистично проаналізовані, як це було детально описано далі.

Ex vivo ізоляція шкірних ЛЕК.

Мікропрепарат ЛЕК проводили, як описано раніше (10). Коротко кажучи, шкіру людини дерматомізували, а епідерміс та дерму вивихнули шляхом інкубації в розчині диспази (Roche № 04942086001). Клітини маркували антитілами в триступеневій процедурі з проміжними етапами промивання та сортували (FACStar Plus; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) як LEC (CD31 + подопланін позитивний) та ендотеліальні клітини крові (CD31 + подопланін негативний) із застосуванням CD45 як ворота для виключення лейкоцитів.

Виділення РНК та гібридизація чіпів.

Аналіз GeneChip проводили, як описано раніше (10). Коротко, загальна РНК (RNeasy Mini Kit; Qiagen No. 74104) була ампліфікована (MessageAmp II aRNA Amplification Kit; Ambion No. AM1751), а 1 мкг ампліфікованої РНК мічений біотином, очищений (MessageAmp II-Biotin Enhanced Kit, Ambion no AM1791) та гібридизований до Affymetrix GeneChips (GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 Arrays), які були відскановані за допомогою GeneChip Scanner 3000 7G.

Біоінформаційний аналіз даних.

Профілі експресії генів dLEC та недіабетичного LEC (ndLEC) аналізували за допомогою програмного забезпечення GeneSpring GX (Ambion). Після фонової корекції вихідні дані нормалізували за допомогою надійного багаторядового середнього методу, а значення P обчислювали неспареним t-тестуванням. Згодом для ієрархічної кластеризації на основі сутностей та умов згідно з правилами метрики Евклідової відстані та центроїдних зв’язків використовували 1828 наборів зондів з Р ≤ 0,05. Усі дані були депоновані в Національному центрі біотехнологічної інформації (NCBI) Gene Expression Omnibus (GEO) і доступні за номером приєднання GEO GSE38396 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc. cgi? acc = GSE38396). Подальший поглиблений біоінформаційний аналіз проводили методом відносної дисперсії (RVM), який дозволяє проводити статистичний аналіз малих розмірів вибірки на основі самоадаптивного порогу (11). До масштабних досліджень NCBI GEO та PubMed (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez) було внесено зміни з метою отримання інформації про експресію генів та значення для біології LEC. Онтологія генів (www.affymetrix.com) була використана для класифікації генів відповідно до функціональних можливостей. Аналіз шляху винахідливості (http://www.ingenuity.com) був застосований для виявлення асоціацій з певними функціями, канонічними шляхами та захворюваннями.

Кількісна ланцюгова реакція зворотної транскриптази – полімерази.

Один мікрограм ампліфікованої загальної РНК транскрибувався в кДНК за допомогою зворотної транскриптази Суперскрипту II (Invitrogen № 18064-014). Повний список зондів узагальнено в додатковій таблиці 5.

Культивація шкірного LEC, стимуляція TNF-α та ІФА CXCL10.

LEC були відсортовані від шкірних мікросудинних ендотеліальних клітин шкіри (Promocell № C-12260) магнітними кульками, покритими антиподопланіновими антитілами. LEC вирощували в ендотеліальному базальному середовищі-2 (EBM-2), доповненому 5% FCS та EGM-2-MV SingleQuots (Lonza № CC-4147) при 37 ° C та 5% CO2. Для стимуляції TNF-α ЛЕК між пасажами 5 і 8, вирощені до 70–80% злиття в шестилункових планшетах, голодували протягом ночі в EBM-2/0,5% FCS, а потім середовищі, що містить 10 нг/мл TNF-α (НДДКР. 210-TA-010) протягом 6, 12 та 24 год із додаванням або без 25 нг/мл інгібуючого анти-TNF-α антитіла. LEC лізували за допомогою буфера RL (Qiagen № 79216) та β-меркаптоетанолу для подальшого кількісного аналізу ПЛР (qPCR). Супернатанти культури LEC збирали та концентрували у 20 разів за допомогою відцентрових фільтрувальних установок (Amicon Ultra-0,5 10K Ultracel R; Millipore № UFC501024). Дев'яносто шість лунок ІФА-планшетів покривали концентрованими супернатантами протягом ночі, а ІФА-аналіз CXCL10 проводили згідно із стандартним протоколом (див. Легенду додаткової фігури 8В). Експерименти проводились у трьох примірниках, а статистичні відмінності між групами аналізувались, як було детально описано пізніше.