Потенційний захист від діабету 2 типу при ожирінні завдяки нижчій експресії та покращенню CD36

Анотація

Вступ

Гіперглікемія, спричинена недостатньою дією інсуліну, характеризує діабет 2 типу (T2D). Інсулінорезистентність та дефектна секреція інсуліну є двома основними патогенними факторами захворювання, і обидва вони тісно пов’язані із способом життя та генетичними компонентами (1,2). Ожиріння є одним із сильних факторів ризику розвитку СД2. При ожирінні накопичення ліпідів поширене не тільки в жировій тканині, але і в позаматкових тканинах, таких як печінка та скелетні м’язи. Внутрішньоклітинне накопичення ліпідів в ектопічних тканинах призводить до порушення інсулінової сигналізації та сприяє системній інсулінорезистентності (3). Однак не у всіх людей з ожирінням розвивається T2D, оскільки β-клітини підшлункової залози можуть певною мірою адаптуватися до зростаючої потреби в інсуліні. Дисфункція β-клітин підшлункової залози займає центральне місце у відмові від адаптації до підвищеної резистентності до інсуліну. Дійсно, знижена реакція першої фази на інсулін, принаймні у деяких людей, може спостерігатися вже до розвитку T2D (4). Ці результати свідчать про те, що ті, хто не може адаптуватися до додаткового попиту через підвищену секрецію інсуліну, схильні до T2D.

потенційний

Як і тканини-мішені інсуліну, було показано, що продукуючі інсулін β-клітини пошкоджуються надмірним накопиченням ліпідів - концепція, відома як ліпотоксичність β-клітин (5). У цьому стані накопичені ліпіди, зокрема триацилгліцерин, спричинюють клітинний стрес, дисфункцію та загибель β-клітини. Насправді, збільшене накопичення крапель ліпідів спостерігається при збільшенні ІМТ у β-клітинах людини (6). У ряді досліджень in vitro були виявлені механізми, що впливають на порушення секреції інсуліну внаслідок підвищення хронічної жирної кислоти (ФА) (7,8), включаючи ті, що впливають на екзоцитоз (9). Більше того, передача сигналів інсуліну в β-клітинах необхідна не тільки для росту, але і для належної регуляції клітинної функції (10–12). Отже, разом ці висновки вказують на те, що резистентність до інсуліну та дефектна секреція інсуліну, ймовірно, мають спільну етіологію з точки зору накопичення ліпідів. Як ендогенний синтез FA, так і поглинання FA вважаються причинно важливими для збільшення накопичення ліпідів у β-клітинах (13,14).

У цьому дослідженні ми показали, що серед донорів людини з ожирінням здатність секреції інсуліну на острівцях підшлункової залози та екзоцитоз β-клітин були значно нижчими у донорів з T2D, ніж у не-T2D (ND). Ми порівняли рівні експресії транспортерів FA на їхніх острівцях, щоб вирішити роль полегшеного засвоєння FA для дефектної секреції інсуліну. Далі ми детально вивчили сигнальний шлях, задіяний у модульованій CD36 секреції інсуліну в β-клітинах, використовуючи клітини INS-1, що несуть систему Tet-on для надмірної експресії CD36. Нарешті, ми протестували терапевтичний потенціал CD36-нейтралізуючого антитіла для поліпшення функції β-клітин у людських клітинах EndoC-βH1.

Дизайн та методи дослідження

Клітинна лінія та культура

Клітини INS-1, що містять систему Tet-on для надмірної експресії CD36 (15), культивували із середовищем RPMI 1640, що містить 11,1 ммоль/л глюкози, 10% FBS, 100 МО/мл пеніциліну, 100 мкг/мл стрептоміцину, 50 мг/мл неоміцину, 50 мг/мл гігроміцину, 10 ммоль/л HEPES, 1 ммоль/л пірувату натрію та 50 мкмоль/л β-меркаптоетанолу при 37 ° C у зволоженій атмосфері з 5% CO2. Для індукції експресії CD36 клітини висівали в 24- або 48-лункові планшети та культивували з донгсицикліном 500 нг/мл або без нього (Sigma-Aldrich, Сент-Луїс, Міссурі) протягом 72 год.

Клітини EndoC-βH1 (16) культивували в посудинах з покриттям Matrigel/фібронектином (100 мкг/мл та 2 мкг/мл відповідно) (Sigma-Aldrich) з DMEM, що містить 5,6 ммоль/л глюкози, 2% BSA, 10 ммоль/L нікотинаміду, 50 мкмоль/л β-меркаптоетанолу, 5,5 мкг/мл трансферину, 6,7 нг/мл селеніту натрію, 100 МО/мл пеніциліну та 100 мкг/мл стрептоміцину при 37 ° C у зволоженій атмосфері з 5% CO2. Клітини висівали в 48-лункові планшети, покриті матригелем/фібронектином, і культивували протягом 72 годин 2 мкг/мл антитіла, що блокує CD36 (FA6.125, каталожний номер 60084; STEMCELL Technologies, Ванкувер, Британська Колумбія, Канада) або контроль ізотипу (MOPC-21, каталожний номер ab18443; Abcam, Кембридж, Великобританія).

Острівці підшлункової залози людини

Острівці підшлункової залози людини були отримані від донорів-трупів європейського походження Північною мережею з трансплантації клінічних острівців. Острівці обробляли, як описано раніше (17), і перед використанням підбирали їх під стереомікроскопом. Для дисоціації на поодинокі клітини острівці інкубували з 3 ммоль/л EGTA у збалансованому розчині солі Хенкса, що містить 0,25% BSA, протягом 15 хв при 37 ° C з подальшим акуратним піпетуванням. Характеристики донорів для кожного експерименту наведені в додатковій таблиці 1. Усі процедури з використанням людських острівців були схвалені етичними комісіями в Уппсалі та Мальме/Лунді, Швеція.

Аналіз даних секвенування РНК людських острівців

Дані РНК-секвенування острівців (RNA-seq) були отримані з Онібусу генної експресії з номерами приєднання GSE50398 та GSE108072 з досліджень Fadista et al. (18) та Gandasi et al. (19) відповідно. Значення виразу виражаються як кількість log2 на мільйон після нормалізації та перетворення з використанням voom. Рівні експресії відібраних генів отримували у 68 донорів із нормальною масою тіла (ІМТ 2) та 31 донорів із ожирінням (ІМТ ≥30 кг/м 2).

Аналіз секреції інсуліну

Для CD36 INS-1 клітин після двічі промивання 1 мл попередньо підігрітого буфера для аналізу секреції (SAB) (1,16 ммоль/л MgSO4, 4,7 ммоль/л KCl, 1,2 ммоль/л KH2PO4, 114 ммоль/л NaCl, 2,5 ммоль/л CaCl2, 25,5 ммоль/л NaHCO3, 20 ммоль/л HEPES і 0,2% BSA, рН 7,2) з 2,8 ммоль/л глюкози, клітини попередньо інкубували в 0,5 мл SAB з 2,8 ммоль/л глюкози протягом 1 години. Потім клітини стимулювали протягом 1 год у 0,25 мл SAB з 2,8 ммоль/л глюкози або 16,7 ммоль/л глюкози або протягом 15 хв у 0,25 мл SAB з 2,8 ммоль/л глюкози та 50 ммоль/л KCl при 37 ° C. Рівні секретированного інсуліну вимірювали за допомогою ELISA для інсуліну щурів (Mercodia, Уппсала, Швеція), і значення нормалізували до вмісту білка. Білок екстрагували 100 мкл буфера RIPA (0,1% SDS, 150 нмоль/л NaCl, 1% Triton X-100 та 50 ммоль/л Tris-HCl, рН 8,0), а вміст аналізували за допомогою набору для аналізу білка BCA (Thermo Fisher Scientific).

Для клітин EndoC-βH1 культуральне середовище змінили на середовище, що містить 2,8 ммоль/л глюкози, і додатково інкубували протягом 18 годин перед аналізом секреції. Після двох промивань 1 мл SAB, що містить 1 ммоль/л глюкози, клітини попередньо інкубували в 0,5 мл SAB з 1 ммоль/л глюкози протягом 2 годин. Потім клітини стимулювали протягом 15 хв 0,25 мл SAB з 1 ммоль/л глюкози або 20 ммоль/л глюкози при 37 ° C. Рівні секретованого інсуліну вимірювали за допомогою ІФА людського інсуліну (Mercodia), і значення нормалізували до вмісту білка. Вміст білка вимірювали, як зазначено вище.

Для людських острівців секрецію інсуліну, стимульовану глюкозою, досліджували за допомогою динамічної перифузійної системи глюкози, щоб обчислити індекс стимуляції як контроль якості (20). Для оцінки індукованої деполяризацією мембрани секреції інсуліну партії 12 острівців попередньо інкубували протягом 30 хв у бікарбонатному буфері Кребса-Рінгера, рН 7,4, додавали 20 ммоль/л HEPES, 0,1% BSA та 1 ммоль/л глюкози, а потім стимулювали для 1 год у бікарбонатному буфері Кребса-Рінгера з 70 ммоль/л KCl і 1 ммоль/л глюкози.