Профілактичні ефекти та механізми часнику на дисліпідемію та дисбіоз мікробіомів кишечника
Кей Чен
Кун Се
Чжуїн Лю
Ясусі Накасоне
Кодзуе Сакао
Пані Амзад Хоссейн
3 Сільськогосподарський факультет, Університет Рюкюса, Окінава, 903-0213, Японія
Де-Сін Хоу
4 Сільськогосподарський факультет Університету Кагосіми, Кагосіма 890-0065, Японія
Анотація
1. Вступ
Часник (Allium sativum L.) здавна використовується як у кулінарних, так і в лікувальних цілях багатьма культурами. Виходячи зі свіжої ваги, часник містить воду (62–68%), вуглеводи (26–30%), білки (1,5–2,1%), амінокислоти (1,0–0,5%), сполуки сірки (1,1–3,5%) та клітковина (1,5%). Вуглеводи - це найпоширеніший клас сполук, що містяться в цибулинах часнику, і на них припадає близько 77% сухої маси. Більшість вуглеводів у часнику складаються з розчинних у воді полімерів фруктози, які називаються фруктанами [1], що становить приблизно 65% сухої маси [2]. Фруктани часнику - це полімеризовані полісахариди з високою молекулярною масою, починаючи від l-цистеїнів (G-SAC), які гідролізуються та окислюються з отриманням сульфоксидів S-аліл-l-цистеїну (алліїну) під час зберігання [11]. Подрібнення, подрібнення чи жування часнику вивільняє алііназу, яка каталізує алліїн до аліцину та інших тіосульфатів [12]. Вважається, що алліцин відповідає за більшу частину фармакологічної активності подрібнених сирих зубчиків часнику [13]. Вважається, що ці ОСК є біоактивними принципами для численних переваг для здоров’я [14], особливо для захисних компонентів із широкою антимікробною активністю.
Кишкові мікроби відіграють важливу роль у підтримці здорового організму [15]. Доведено, що дієтичні добавки з рисовими висівками та темно-синіми бобами [16], поліфенолами дендробію [17] та прополісом [18] впливають на склад та активність мікробіоти кишечника [19]. Харчування з високим вмістом жиру (HFD) модулює склад мікробіому кишечника, зменшуючи поширеність певних бактерій, що захищають кишковий бар’єр, і збільшуючи поширеність умовно-патогенних мікроорганізмів, які можуть вивільняти вільні антигени, такі як ліпополісахариди. Цей дисбаланс може бути пов'язаний з вищою проникністю кишечника, що призводить до вищих рівнів ендотоксину та факторів запалення у плазмі крові та, зрештою, до розвитку метаболічних порушень [20,21].
Складні інгредієнти часнику, мабуть, мають парадоксальні результати щодо мікробіому кишечника. Експерименти з відокремленими сполуками показали, що фруктани працюють як пребіотики для мікробіому кишечника [22], тоді як OSC часнику, такі як аліцин, тіосульфінати та аджоен, діють як антибактеріальні засоби [23,24]. Тому необхідно з’ясувати вплив споживання цілого часнику в повсякденному житті на мікробіом кишечника. У цьому дослідженні ми використовували модель миші з нормальним харчуванням (НД) та ВЧС, щоб дослідити вплив та механізми цільного часнику на мікробіом кишечника. Декстрин використовували як позитивний контроль, оскільки декстрин є полісахаридом [25], подібним до фруктану, і може стимулювати ріст пробіотичних штамів, таких як Actinobacteria і Bacteroidetes [26], та зменшення кількості патогенних бактерій [27].
2. Матеріали та методи
2.1. Хімічні речовини та реактиви
Часник збирали з поля ґрунту в префектурі Аоморі, Японія. Після сушіння на гарячому повітрі (вміст вологи 60%) часник зберігали при -2 ° C протягом 10 місяців, а потім подрібнювали у вигляді подрібненого часнику сирого порошку (вміст вологи 4,8%). Кількості OSC та фруктану у часниковому порошку визначали за допомогою ВЕРХ або набору для аналізу фруктану (Biocon Ltd., Нагоя, Японія) відповідно (Додаток A, Таблиця A1).
Неперетравлюваний декстрин отримували із природного кукурудзяного крохмалю з 95% декстрину та 5% води. Олія сало отримували з фірми Sigma-Aldrich Japan (Токіо, Японія). Склад поживних речовин дієт наведено в Додатку А, таблиці А2. ND містив 21% білка, 6% жиру, 54% вуглеводів, 4% целюлози та приблизно 370 ккал/100 г калорій. HFD містив 21% білка, 40% жиру, 10% вуглеводів, 4% целюлози та приблизно 570 ккал/100 г калорій.
2.2. Модель миші
Експериментальний протокол на тваринах був складений відповідно до керівних принципів Комітету з догляду та використання тварин Університету Кагосіми (Дозвіл № A12005). Самці мишей C57BL/6N (віком 5 тижнів) від Japan SLC Inc. (Сідзуока, Японія) розміщувались окремо в клітках з підстилкою з деревної стружки під контрольованим освітленням (12-годинне світло/дні) та температурою (25 ° C), і вільний доступ до води та кормів. Масу тіла мишей зважували раз на тиждень. Після акліматизації протягом 7 днів (вік 6 тижнів) мишей випадковим чином поділяли на шість груп (n = 5) і годували ND, NDG (5% часнику в ND), NDD (4% декстрину в ND), HFD, HFDG (5% часнику в HFD) або HFDD (4% декстрину в HFD). Після 12 тижневого годування (віком 18 тижнів) мишей забивали після нічного голодування. Свіжий кал збирали на початку (вік 6 тижнів) і в кінці експерименту (вік 18 тижнів) для дослідження мікробіома кишечника, пов’язаного з різним віком або дієтою.
2.3. Вимірювання біохімічних показників сироватки крові
Сироватки крові отримували з очних яблук мишей і збирали їх у пробірку з коагулянтом (сепарабельні мікропробірки, FUCHIGAMI, 170720, Кіото, Японія) протягом 30 хв при кімнатній температурі для правильної коагуляції; їх збирали центрифугуванням при 3000 об/хв протягом 5 хв і зберігали при - 80 ° C до використання. Рівні глутаміно-оксалооцтової трансамінази (GOT), глутаміно-піровиноградної трансамінази (GPT), гамма-глутаміл-трансферази (GGT), загального холестерину (T-Cho), загального триацилгліцерину (TG), ліпопротеїдів високої щільності (HDL-c) ), а глюкозу вимірювали за допомогою автоматизованого аналізатора клінічної хімії (SPOTCHEM EZ SP-4430, Arkray, Кіото, Японія). Рівень ЛПНЩ (ліпопротеїдів низької щільності) розраховували за допомогою рівняння Фрідевальда (ЛПНЩ = T-Cho - HDL-c - TG/5) [28]. Концентрацію інсуліну в сироватці крові вимірювали за допомогою набору ELISA (Thermo Fisher Scientific Inc., Рокфорд, Іллінойс, США) відповідно до інструкцій виробника. Індекс оцінки гомеостатичної моделі на інсулінорезистентність (HOMA-IR) розраховували з функцією глюкози натще × інсуліну натще/405 [29].
2.4. Гістоморфологія
Тканину клубової кишки мишей розрізали за допомогою системи заморожування мікротомів (Ямато, Сайтама, Японія) відповідно до інструкцій виробника. Потім отриманий зріз (7 мкм) фарбували фарбуванням гематоксилін-еозином (H&E) і спостерігали під флуоресцентним мікроскопом (Keyence, Токіо, Японія).
2.5. Аналізи органічної кислоти цекалів
Сліду кишку та вміст сліпої кишки ізолювали та зважували. Кожну 0,3 г проби вмісту сліпої кишки переносили в 0,6 мл дистильованої води і витримували на льоду протягом 10 хв після додавання 0,09 мл 12% пероксидної кислоти. Надосадову рідину фільтрували після центрифугування з 15000 × g при 4 ° C протягом 10 хв, а потім використовували для аналізу органічної кислоти з використанням високоефективної рідинної хроматографії, що виключає іони, за допомогою насоса LC-10AD (Shimadzu, Кіото, Японія) та вимірювача електропровідності (Waters431, Кіото, Японія). Ідентифікація компонентів проводилася за допомогою модуля даних CBM-20A (Shimadzu, Кіото, Японія) [30].
2.6. Характеристика мікробіому кишечника шляхом секвенування генів 16S рРНК
Фекалії мишей збирали у мишей, розміщених у різних клітках у віці 6 та 18 тижнів, і зберігали при -80 ° C до використання. Геномну ДНК калу витягували за допомогою спінового набору Fast DNA для фекалій (MP BIOMEDICALS) згідно з інструкціями виробника та використовували для аналізу складу бактеріальних спільнот кишечника шляхом секвенування генів 16S рРНК, як описано в нашій попередній роботі [31].