Профілювання транскриптома виявляє значні зміни зовнішньої мускулатури шлунка при ожирінні
Анотація
Передумови
Випорожнення шлунка порушується у пацієнтів з гастропарезом, тоді як воно або не змінюється, або прискорюється у людей із ожирінням. Метою поточного дослідження було виявити зміни в експресії генів у м’язовому шлунку, які можуть сприяти зміні моторики шлунка при ідіопатичному гастропарезі та ожирінні.
Методи
Кількісна RT-PCR в режимі реального часу та секвенування цілих транскриптомів використовувались для порівняння транскриптомів худорлявих осіб, людей із ожирінням та худих або ожирілих осіб з ідіопатичним гастропарезом.
Результати
Ожиріння призводить до збільшення мРНК, пов'язаних із скоротливістю м'язів, тоді як ідіопатичний гастропарез призводить до зменшення іРНК, пов'язаних з передачею сигналів PDGF BB. Як ожиріння, так і ідіопатичний гастропарез також були пов'язані з подібними змінами шляхів, пов'язаних із запаленням.
Висновки
Наші висновки показують, що ожиріння та ідіопатичний гастропарез призводять до перекриття, але чітких змін у транскриптомі шлункового м’яза. Підвищена експресія мРНК, що кодує скорочувальні білки гладкої мускулатури, може сприяти збільшенню перистальтики шлунка, що спостерігається у осіб із ожирінням, тоді як зменшення передачі сигналів PDGF BB може сприяти порушенню моторики, що спостерігається у осіб з ідіопатичним гастропарезом.
Передумови
Методи
Клінічна оцінка
Усі процедури проводились за протоколом, затвердженим Інституційною комісією з огляду університету Індіани. Інформовані згоди були отримані від контрольних суб’єктів та пацієнтів з ідіопатичним гастропарезом. Ідіопатичний гастропарез визначали як пацієнтів із симптомами гастропарезу ≥3 місяців із затримкою спорожнення шлунка за допомогою 4-годинної сцинтиграфії шлунка або наявністю шлункового безоару з неперетравленими продуктами шляхом верхньої ендоскопії після нічного голодування. Сцинтиграфію шлунка проводили після споживання нежирного яєчно-білкового шроту з візуалізацією через 0, 2 та 4 години, як описано раніше [18, 19]. Аномальне спорожнення шлунка визначалося як 2-годинне утримання ≥60% або 4-годинне утримання ≥10%. У пацієнтів із гастропарезом, які були включені в дослідження, не було діабету, що визначали нормальним вмістом глюкози натще або нормальним гемоглобіном А1с (HbA1c) за допомогою аналізу крові. Ми також виключили суб'єктів з іншими системними захворюваннями, такими як хірургічне втручання при вагінальній травмі, склеродермія, змішані розлади сполучної тканини та паранеопластичний синдром.
Біопсія шлунка на всю товщину
Біопсії контрольної групи з низьким ІМТ (не повідомлялося про діабет чи гастропарез) були отримані від донорів, які пересаджували органи на момент трансплантації органів. Біопсії контрольної групи з високим ІМТ були отримані від осіб без діабету без симптомів гастропарезу, які перенесли баріатричну операцію для зниження ваги (нормальний рівень HbA1c 7. Рівні ATP4A та мРНК гастрину аналізували у всіх зразках методом qRT-PCR для скринінгу на забруднення слизової Для подальшого аналізу використовувались лише зразки, які мали рівні експресії цих маркерів, які були менш ніж у 100 разів нижчі за рівні, наявні в слизовій.
Підготовка та послідовність бібліотеки
Концентрацію та якість загальних зразків РНК вперше оцінили за допомогою біоаналізатора Agilent 2100. Для проходження контролю якості потрібен RIN (RNA Integrity Number) 7 або вище. Потім 200 нг РНК на зразок використовували для приготування подвійної індексованої ланцюгової бібліотеки кДНК з використанням набору Hyperprep Kit мРНК KAPA (Roche). Отримані бібліотеки оцінювали за їх розподілом за кількістю та розмірами за допомогою біоаналізатора Qubit та Agilent 2100. Двісті пікомолярних бібліотек, об'єднаних у пул, використовувались для посилення кластеризації на cBot за допомогою кластерного набору HiSeq 3000/4000 PE та послідовно конфігурували парним кінцем 2,75 bp на HiSeq4000 (Illumina) за допомогою HiSeq 3000/4000 PE SBS Kit. Для вимірювання якості секвенування використовували оцінку якості Фреда (оцінку Q). Більше 90% зчитувань послідовності досягли Q30 (99,9% базової точності дзвінка). Секвенування проводили в Центрі медичної геноміки (CMG) при Медичній школі університету Індіани, основному закладі секвенування CTSI в Індіані.
Вирівнювання послідовності та кількість генів
Дані послідовності спочатку оцінювали за допомогою FastQC (Babraham Bioinformatics, Кембридж, Великобританія) для контролю якості. Потім усі послідовно послідовно бібліотеки були зіставлені з геномом людини (UCSC hg38) за допомогою вирівнювача RNA-seq STAR [20] із наступним параметром: “--outSAMmapqUnique 60”. Розподіл читань по геному оцінювали за допомогою бамутилів (від ngsutils) [21]. Унікально зіставлені зчитування послідовності були присвоєні генам hg38 refGene з використанням featureCounts (з підчитування) із такими параметрами: “-s 2 –p –Q 10” [22]. Контроль якості послідовності та відображення результатів було підсумовано за допомогою MultiQC [23]. Зберігали гени з числом зчитування на мільйон (CPM)> 0,5 у більш ніж 4 зразках. Дані нормалізували за допомогою методу TMM (обрізане середнє значення M). Середня кількість однозначно зіставлених зчитувань, отриманих на вибірку, становила 28,7 мільйона (86,96% необроблених зчитувань) при мінімумі 22,3 мільйона і максимум 32 мільйона. Аналіз диференціальної експресії проводили за допомогою edgeR [24, 25]. Швидкість помилкового виявлення (FDR) була обчислена з стор-значення за допомогою процедури Бенджаміні-Хохберга. Повні дані щодо послідовності РНК доступні в базі даних NCBI GEO, номер приєднання GSE129398.
qRT-ПЛР. 500 нг РНК використовували в реакціях зворотної транскрипції (RT-cDNA Kit з високою ємністю, Life Technologies). ПЛР у режимі реального часу проводили з використанням Sybr Green (Roche). Рівні експресії мРНК нормалізувались до експресії TATA-зв'язуючого білка (TBP) як внутрішній контроль і виражаються відносно середніх значень, які спостерігаються у зразках контрольних пацієнтів з низьким ІМТ. Праймери, що використовуються для qRT-PCR, перелічені в додатковому файлі 4: Таблиця S1