Протимікробна інактивація синього світла грамнегативних збудників у біоплівках in vitro та in vivo
Юченг Ван
1 відділення лазерної медицини, китайська загальна лікарня НВО, Пекін
2 Медичний коледж Університету Нанкай, Тяньцзінь
4 Центр фотомедицини Велмана, Загальна лікарня штату Массачусетс, Гарвардська медична школа, Бостон
Сімін Ву
4 Центр фотомедицини Велмана, Загальна лікарня штату Массачусетс, Гарвардська медична школа, Бостон
Цзя Чень
3 Шанхайська дерматологічна лікарня, Китай
4 Центр фотомедицини Велмана, Загальна лікарня штату Массачусетс, Гарвардська медична школа, Бостон
Реабілітація Амін
4 Центр фотомедицини Велмана, Загальна лікарня штату Массачусетс, Гарвардська медична школа, Бостон
Мін Лу
4 Центр фотомедицини Велмана, Загальна лікарня штату Массачусетс, Гарвардська медична школа, Бостон
Бріш Бхаяна
4 Центр фотомедицини Велмана, Загальна лікарня штату Массачусетс, Гарвардська медична школа, Бостон
Цзе Чжао
4 Центр фотомедицини Велмана, Загальна лікарня штату Массачусетс, Гарвардська медична школа, Бостон
Клінтон К. Мюррей
7 Інфекційна служба, медичний центр армії Брук, форт Сем Х'юстон, штат Техас
Майкл Р. Гамблін
4 Центр фотомедицини Велмана, Загальна лікарня штату Массачусетс, Гарвардська медична школа, Бостон
6 Гарвард-Массачусетський технологічний відділ, Наука та технології охорони здоров'я, Кембридж, штат Массачусетс
Девід С. Хупер
5 Відділ інфекційних хвороб, Масачусетська загальна лікарня, Гарвардська медична школа, Бостон
Тяньхонг Дай
4 Центр фотомедицини Велмана, Загальна лікарня штату Массачусетс, Гарвардська медична школа, Бостон
Анотація
Передумови. Біоплівки впливають на> 80% бактеріальних інфекцій у людини, і їх, як правило, важко викорінити через властиву їм лікарську стійкість.
Методи. Ми досліджували ефективність протимікробного синього світла (aBL) (довжина хвилі, 415 нм) для інактивації біоплівки Acinetobacter baumannii або Pseudomonas aeruginosa в мікропланшетах з 96 лунками або інфікованих мишачих ранах.
Результати. In vitro на 96-лункових мікропланшетах вплив 24-годинної та 72-годинної біоплівки A. baumannii на 432 Дж/см 2 aBL призвело до інактивації 3,59 log10 та 3,18 log10 колонієутворюючих одиниць (CFU), відповідно. Для біоплівки P. aeruginosa були досягнуті подібні рівні інактивації - 3,02 log10 та 3,12 log10 CFU, відповідно. У опікових ранах миші, інфікованих 5 × 10 6 КУО A. baumannii, потрібно було приблизно 360 Дж/см 2 та 540 Дж/см 2 aBL, щоб інактивувати 3 log10 КУО в біоплівках при доставці через 24 та 48 годин після бактеріального посіву. . Високоефективний аналіз рідинної хроматографії виявив наявність ендогенних порфіринів як у A. baumannii, так і у P. aeruginosa. Аналіз TUNEL не виявив апоптотичних клітин в опроміненій BL шкірі миші протягом 24 годин після впливу aBL (540 Дж/см 2).
Висновки. aBL має протимікробну активність у біоплівках A. baumannii та P. aeruginosa і є потенційним терапевтичним підходом до інфекцій, пов'язаних з біоплівкою.
Біоплівки впливають на> 80% бактеріальних інфекцій у людини [1]. У біоплівках живі бактерії об’єднані у високогідратований позаклітинний матрикс [2, 3]. Виснаження метаболічних речовин або накопичення відходів у біоплівках призводить до того, що бактерії переходять у повільний або незростаючий (стаціонарний) стан [3]. Як наслідок, біоплівки більш толерантні до звичайних антимікробних препаратів та захисних сил господаря порівняно з їх планктонними аналогами [4, 5], і асоціюються із стійкими інфекціями [6, 7]. Ситуація погіршується збільшенням появи мультирезистентних штамів бактерій, особливо мультирезистентних грамнегативних бактерій [8]. Потрібні нові терапевтичні підходи для боротьби з резистентністю до наркотиків при інфекціях, пов’язаних з біоплівкою [9].
Новий антимікробний підхід на основі світла - антимікробне блакитне світло (aBL) привертає все більшу увагу завдяки своєму властивому антимікробному ефекту без участі екзогенних фотосенсибілізаторів [10–14]. Механізм, що лежить в основі антимікробної активності АБЛ, досі не до кінця вивчений. Поширеною гіпотезою є те, що aBL збуджує природні ендогенні фотосенсибілізуючі хромофори (переважно беззалізні порфірини) і згодом призводить до утворення цитотоксичних активних форм кисню (АФК) [14]. У наших попередніх дослідженнях ми продемонстрували, що aBL селективно інактивує планктонні клітини бактерій (включаючи мультирезистентні штами), зберігаючи клітини хазяїна, і що він успішно усуває гострі інфекції при ранах мишей [15-17]. У цьому дослідженні ми додатково досліджували ефективність інактивації АБЛ біоплівки Pseudomonas aeruginosa та Acinetobacter baumannii в мікропланшетах з 96 лунками або опікових ранах миші з встановленими інфекціями.
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ
Джерело синього світла
Для опромінення AB використовували прототип світлодіода (світлодіод; Vielight, Торонто, Канада) з піковим випромінюванням при 415 нм і повною шириною при половині максимуму 10 нм. Світлодіод був встановлений на радіаторі, щоб запобігти тепловому впливу на опромінену ціль. Опромінення на поверхні цілі регулювалося шляхом маніпулювання відстанню між апертурою джерела світла та ціллю і вимірювалось за допомогою вимірювача потужності/енергії PM100D (Thorlabs, Newton, New Jersey).
Штами бактерій
Бактеріальними штамами, що використовувались у цьому дослідженні, були P. aeruginosa ATCC 19660 (штам 180) та мультирезистентний клінічний ізолят A. baumannii. Обидва штами були зроблені біолюмінесцентними шляхом трансфекції люкс-оперону у штами бактерій, як було описано раніше [18, 19], що дозволяє здійснювати моніторинг біолюмінесценції бактерій у режимі реального часу за допомогою зображень біолюмінесценції. Бактерії регулярно вирощували в середовищі для інфузії серця (BHI), доповненому 50 мкг/мл канаміцину в орбітальному інкубаторі (37 ° C; 1300 г).
Співвідношення бактеріальної люмінесценції до колонієутворюючих одиниць (КУО) у біоплівках
Суспензії бактерій у BHI інкубували на 96-лункових мікропланшетах (200 мкл/лунка; приблизно 10 6 КУО/мл) протягом 24 годин, щоб забезпечити ріст біоплівки [20–22]. Наприкінці інкубаційного періоду біоплівки ретельно промивали двічі забуференним фосфатом фізіологічним розчином (PBS), щоб видалити неадгезивні бактерії, і в кожну лунку додавали 200 мкл PBS. Потім біоплівки в різних свердловинах піддавали впливу АБЛ при опроміненні 100 мВт/см 2 протягом різних періодів. Після експозиції aBL біоплівки піддавали як вимірюванню інтенсивності люмінесценції (у відносних одиницях світла [RLU]) за допомогою багатопластового зчитувача Віктор-2 1420 (EG&G Wallac, Гейтерсбург, штат Меріленд) та аналізу колонії. Для колонієутворюючого аналізу кожну лунку ретельно промивали, а потім вібрували обробкою ультразвуком протягом 1 хвилини. Потім суспензії збирали і висівали на агар BHI після серійних розведень, використовуючи метод, описаний раніше [23]. Загальну кількість КУО у біоплівках визначали та лінійно встановлювали з відповідною бактеріальною люмінесценцією.
aBL Інактивація бактерій у біоплівках in vitro
Суспензії бактерій у відварі BHI інкубували на 96-лункових мікропланшетах (200 мкл/лунка; приблизно 10 6 КУО/мл) протягом 24 або 72 годин, щоб забезпечити ріст біоплівки [20–22]. Під час інкубації культуральне середовище змінювали через день. В кінці інкубації біоплівки ретельно промивали двічі за допомогою PBS, і в кожну лунку додавали 200 мкл свіжого PBS. Потім біоплівки опромінювали aBL при опроміненні 100 мВт/см 2. У різні моменти часу після ініціювання опромінення AB, бактеріальну люмінесценцію біоплівки вимірювали за допомогою багатопластового зчитувача пластин, а життєздатність бактерій у біоплівках оцінювали на основі люмінесценції бактерій. Експеримент проводили у 4 повторах для кожної умови.