Регуляція інсуліну експресії мРНК PDK4 скелетних м’язів порушує екстремальну стійкість до інсуліну

Анотація

Аналіз нозерн-блот на рівні мРНК PDK2 та PDK4.

Екстракцію РНК та аналіз нозерн-блот проводили, як описано раніше (10). Коротко кажучи, загальну РНК виділяли із заморожених м’язів за допомогою Tri Reagent від Центру молекулярних досліджень (Цинциннаті, Огайо) згідно з інструкціями виробника. Електрофорез проводили, використовуючи по 25 мкг кожного препарату РНК у 1% денатураційному гелі. Потім РНК капілярно переносили на нейлонову мембрану із позитивним зарядом (BrightStar-Plus; Ambion, Austin, TX). Зонди кДНК для щурів PDK2 та PDK4 були отримані за допомогою RT-PCR із використанням набору Ad-RTT PCR Advantage від Clontech (Пало-Альто, Каліфорнія) та наступних праймерів: PDK-4, 5′-CGTCGCCAGAATTAAAGCTC та 3′-CTGCCAGTTTCTCCTTCGAC та PDK -2, 5′-GTCAGCTAGGGGCCTTCTCT та 3′-CAGGACTATGCAGGCAGTGA. Зонди кДНК маркували [32 P] dCTP (Perkin Elmer), використовуючи набір для маркування ДНК DECAprime (Ambion). Гібридизацію проводили при 42 ° C у розчині Ultrahyb (Ambion). Відносну щільність авторадиографів визначали кількісно за допомогою молекулярного аналітика Bio-Rad. Для контролю навантаження РНК усі клякси кількісно визначали на вміст гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогенази за допомогою зонда, включеного в набір для маркування ДНК DECAprime (Ambion).

інсуліну

Вестерн-блот-аналіз на рівні загального та фосфорильованого білка Akt та FOXO1.

Інші аналізи.

Глюкозу в плазмі крові аналізували методом глюкозооксидази на аналізаторі глюкози Бекмана II (Beckman, Fullerton, CA). Інсулін у плазмі крові вимірювали радіоімуноаналізом, використовуючи набір Linco Research (Сент-Чарльз, Міссурі). FFA у плазмі вимірювали за допомогою колориметричного набору на основі ацил-КоА-оксидази (Wako Chemicals, Richmond, VA). Лактат плазми вимірювали методом лактатоксидази на аналізаторі лактату YSI (Yellow Springs Instruments, Yellow Springs, OH).

Статистичний аналіз.

Дані виражаються як середні значення ± SE. Значимість відмінностей середніх значень між різними групами лікування оцінювали за допомогою одностороннього ANOVA з подальшим спеціальним аналізом за допомогою тесту Тукі. Для оцінки одновимірної кореляції використовували кореляцію Пірсона. Р 2 ммоль/л (Р 0,05). Крім того, рівень мРНК PDK2 не змінився в результаті остаточної 5-годинної інфузії інсуліну у всіх трьох (тобто фізіологічному, інтраліпідному та лактатному) групах інфузій (Р> 0,05). На відміну від цього, рівень мРНК PDK4 пригнічувався інсуліном на> 80% у контрольній групі з фізіологічним розчином (обговорення P). Подібні результати були отримані в м'язі підошви (рис. 3), який містить переважно окислювальні волокна з повільним смиканням (порівняно з волокнами, що швидко смикаються в м'язах шлунково-кишкового тракту), що свідчить про те, що вплив інсуліну на експресію мРНК PDK4 та його зміни в резистентних до інсуліну станах є незалежно від типу м’язових волокон.

Наше попереднє дослідження (10) продемонструвало, що 5-годинна інфузія інсуліну мала глибокий (~ 72%) ефект для зниження рівня мРНК PDK4, але ефект інсуліну був лише помірним (~ 21%) на рівні білка, припускаючи, що 5- h період інфузії інсуліну не був достатнім часом, щоб знижена транскрипція PDK4 повністю відображалася на рівні білка. У цьому дослідженні ми не визначали рівень білка PDK4, оскільки виявлення зміни незначного впливу інсуліну на рівень білка PDK4 було б практично неможливим або в іншому випадку вимагало б величезної кількості експериментів.