Секвенування цілого геному ідентифікує нову мутацію гена ABCB7 для Х-зчепленого вродженого мозочка

Предмети

Анотація

Вступ

Х-зчеплені вроджені мозочкові атаксії

Генеалогія родини Бурят. Секвенування цілого геному проводили для пацієнта, позначеного стрілкою; суцільні символи позначають постраждалих людей; пунктирні кола - облігатні гетерозиготні самки-носії; відкриті символи - непостраждалі особи; нарізані символи - померлі предмети; зірочки - особини, яких використовували для генотипування. 6

Клінічний опис

Магнітно-резонансна томографія (МРТ) виявила гіпоплазію півкуль мозочка та вермісів у уражених чоловіків із бурятського родоводу. Загальними неврологічними симптомами для всіх постраждалих членів сім'ї були затримка розвитку, труднощі в мовленні та координації, атаксія кінцівок та тулуба та дизартрія (Додаткова таблиця 1). Обстежені пацієнти не мали можливості сидіти без опори будь-коли до 15-місячного віку або самостійно ходити до 7-річного віку та вимовляти свої перші слова до 4-річного віку. У більшості пацієнтів спостерігався ністагм, офтальмоплегія та посилення сухожильних рефлексів. У всіх пацієнтів з цього родоводу не було ознак пам’яті чи когнітивних порушень. 6

Особливостей сидеробластичної анемії або розладу міді не виявлено. Гематологічні дослідження, проведені для пацієнта (III-18) із Х-зчепленою атаксією з бурятського родоводу, не показали відхилень еритропоетичних клітин або скупчення гранул заліза. Значення гемоглобіну в середньому становили 149 г/л (нормальний діапазон - 130–180 г/л), кольоровий показник - в середньому 1,0 (нормальний діапазон - 0,80–1,05), тест седиментації еритроцитів становив у середньому 3 мм/год (діапазон норм - 0–15 мм/h) і кількість лейкоцитів в цілому була нормальною. Усі біохімічні тести були нормальними, за винятком дещо підвищеного рівня білірубіну, 14,5 мг/л (нормальний діапазон, 5–12 мг/л), а аналіз сечі був нічим не примітним. 6

Матеріали і методи

Зразки крові всіх випробовуваних збирали раніше за відповідної поінформованої згоди, і ці дані вже повідомлялись. 6 У родоводі не виявлено спорідненості (рис. 1). Геномна бібліотека була виготовлена із зразка ДНК 2 мкг пацієнта III-17 відповідно до протоколу для парного набору зразків ДНК (Illumina, San Diego, CA, USA). Високопродуктивне секвенування геному проводили на платформі Illumina HiSeq 2000 з мінімум 14-кратною глибиною охоплення геному GRCh37. Аналіз геному проводився за допомогою програмного забезпечення 'ngs-pipeline', розробленого нашою групою http://rogaevlab.ru/ngs-pipeline. Виявлені рідкісні варіанти були надіслані до NCBI ClinVar і доступні за адресою www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/?LinkName=orgtrack_clinvar&from_uid=505407.

Батьківство визначали методом STR (короткий тандемний повтор) з використанням саморобних маркерів STR та системи PowerPlex 16 (Promega, Madison, WI, USA).

Результати

Послідовність цілого геному

Визначення варіантів в ABCB7 і ATP7A гени. Представлення геномної області, що містить мутації, за допомогою інструментів IGV (Integrative Genomics Viewer): (a) екзон 16 з ABCB7 ген (hg19 chrX: g.742734204C> T), () 41,4 кб видаленої області ATP7A ген (hg19 chrX: g.77190006_77231471del), включаючи екзон 2; вертикальні стрілки в (a) та () вказували хромосомні локуси для ABCB7 і ATP7A гени. (c) Перевірка послідовності мутацій кандидата в екзоні 16 з ABCB7 ген. (d) Схема праймерів для перевірки видалення в ATP7A ген. (e) Перевірка послідовності шляхом послідовності видалення Сангера у ATP7A ген у пацієнтів. (f) ПЛР-продукти з ATP7A область, видалена геном: М, ДНК сходи; R, вгору по течії "праворуч", фланкуючий область видалення; В, внутрішнє видалення регіону; L, нижче за течією лівий фланг із зоною делеції (R, In, L - продукти присутні, якщо делеція відсутня; Del - продукт присутній, якщо делеція є у зразку ДНК).

ABCB7 ген

Несинонімний варіант помилки hg19 chrX: g.74273420C> T в екзоні 16 (AF241887) з ABCB7 ген (Ідентифікатор гена: 22) призводить до заміщення гліцину на серин у положенні 682 білка-члена 7, що зв'язує АТФ, касети 7 (NP_001258625, UniProt O75027) (Фігури 2a та c). Оскільки ідентифікований варіант локалізований поблизу ділянки акцепторного сплайсингу в межах першого кодуючого триплета екзону 16, ми дослідили, чи може заміна призвести до утворення нового сильного місця сплайсингу. Біоінформаційні інструменти для тестування передбачуваних місць сплайсингу на основі частот нуклеотидів у кожному положенні ділянки (від -20 до +3) для конститутивних, касетних, внутрішніх акцепторів та зовнішніх акцепторів не передбачали змін сплайсингу для мутантного алелю 18, 19 (Додаткова таблиця 5).

Відомо кілька стенограм ABCB7 ген, що кодує ізоформи білка, і ідентифікований варіант впливає на всі передбачувані ізоформи білка. Структура та функція доменів білка ABCB7 до кінця не вивчені. Мутація розташована в нуклеотидно-зв'язуючому домені (NBD) білка ABCB7 (NP_001258625, UniProt O75027), і порушення цієї області в ортолозі дріжджів ATM1 призводить до втрати функції білка та накопичення заліза всередині мітохондрії (додатковий малюнок 3A) . 20 Ми вивчали структурні зміни в мутантному сериновому варіанті білка ABCB7, використовуючи програму біоінформатики Phyre2. 21 Порівняльний аналіз