Сферичні нуклеїнові кислоти на основі SiRNA зворотно погіршують загоєння ран у діабетичних мишей гангліозидом

Внесено Чадом А. Міркіним, 25 березня 2015 р. (Надіслано на огляд 13 лютого 2015 р .; переглянуто Діном Хо та Вей Лі)

Значимість

Хворі на цукровий діабет часто страждають від погіршення загоєння ран, що може перерости в незагойні діабетичні виразки, полегшити бактеріальні інфекції та вимагати ампутації. Поточні стратегії лікування не змогли досягти очікуваної ефективності та не стосуються основних молекулярних відхилень, що перешкоджають ефективному закриттю ран. У цій роботі ми вводимо невідомий раніше підхід до лікування загоєння діабетичної рани за допомогою сферичних нуклеїнових кислот, що доставляються місцево, для здійснення нокдауну синтази гангліозид-монозалієвої кислоти 3 (GM3), медіатора порушеного загоєння ран, у мишей з діабетом 2 типу. На додаток до створення основи для розробки терапії для виснажливого стану, ця робота також підтверджує критичну роль GM3 у загоєнні діабетичної рани.

Анотація

З 27 мільйонів американців, у яких діагностовано діабет 2 типу (T2D), понад 6 мільйонів мають хронічні незагойні рани шкіри, особливо на підошовній поверхні, що призводить до вторинної бактеріальної інфекції та коштує системі охорони здоров'я понад 25 мільярдів доларів (1, 2). Тільки в 2010 році в США амбутації було піддано понад 70 000 осіб з T2D (3). Потрібно покращити розуміння патології діабетичної рани та нові заходи для погіршення загоєння ран.

Результати

Синтез та характеристика СНС GM3S.

Після первинного скринінгу олігомерів, орієнтованих на GM3S (рис. S1 та таблиця S1), за допомогою звичайної DharmaFECT1-опосередкованої трансфекції нуклеїнової кислоти, п’ять найкращих siРНК з нокдауном> 70% кон’югували з наночастинками золота для отримання СНС. З них дві СНР мали олігонуклеотидні послідовності з ідеальною гомологією між мишами та людиною GM3S і показали> 75% нокдауну як миші, так і людини GM3S. Для всіх терапевтичних досліджень було обрано найефективніший із цих двох, СНР 804 (GM3S СНР) (див. Нижче).

СНС мали ядро наночастинок золота діаметром 13 ± 1 нм, до якого чутливий ланцюг дуплексної siРНК прикріплювався пропілтіоловим зв’язком. Залишилася поверхня золота була заповнена тіольованим олігоетиленгліколем, який функціонує як пасивуючий агент і забезпечує додаткову стійкість частинок у біологічних розчинах (рис. 1А) (13, 14). Динамічне розсіяння та пропускання світла ЕМ-аналізи показали, що СНС GM3S мав середній гідродинамічний діаметр 28 ± 3 нм і залишався диспергованим у розчині (рис. 1В). SN3 GM3S мав середнє навантаження siRNA 40 ± 5 дуплексів siRNA на частинку, і кожен дуплекс siRNA на SNA залишався гібридизованим та стабільним у розчині більше 75 днів (рис. 1C). У сукупності ці дані вказують на те, що наночастинки СНС GM3S є достатньо міцними, стабільними та однорідними для тестування in vitro та in vivo.

Зображення та характеристика СНР. (A) СНС - це 13-нм золоті ядра, щільно функціоналізовані високоорієнтованими тіольованими дуплексами siRNA, які націлені на GM3S. Поверхня СНР пасивується олігоетиленгліколем для колоїдної стабільності. (B) Динамічне розсіювання світла підтверджує, що гідродинамічний діаметр дорівнює 32 нм. (C) Приблизно 40 дуплексів siРНК прикріплені до кожної наночастинки золота, і кількісне визначення протягом 75 днів показує, що кількість повних дуплексів siRNA залишається статистично ідентичною протягом цього періоду часу. Дані про стабільність представлені як середні значення ± SD.

На відміну від необроблених (NT) та безглуздих (NS) оброблених СНК безсмертних мишей KC (mKC), GM3S SNA знижувала і мРНК GM3S, і білок>> 80% при концентрації 5 нМ (на основі концентрації частинок золота та еквівалента до 200 нМ вільної siРНК, оскільки ~ 40 дуплексних siRNA оточують центральну наночастинку). Нокдаун відбувався залежно від дози (рис. 2 А і В). У первинних епідермальних mKCs 2,5 нМ СН3 GM3S СНР збивали іРНК GM3S та білок на 79% та 88% відповідно. Конфокальна імунофлуоресценція імморталізованої миші (рис. 2C) та людських KC (рис. S2) з анти-GM3 антитілами підтвердила майже повну елімінацію експресії гангліозидів GM3 через 72 години лікування СНС GM3S. SNA GM3S була нетоксичною для mKCs у всіх досліджених концентраціях, що оцінювали за допомогою аналізу життєздатності клітин трипанового синього, включаючи концентрації siRNA, токсичні для> 95% mKC, при обробці вільною siRNA, доставленою за допомогою реагенту для трансфекції DharmaFECT1 (рис. 2D).

СНС GM3S виснажує GM3S у природних умовах шляхом шляху RNAi.

Місцеве застосування GM3S SNA запобігає затримці загоєння ран у миші DIO. (А) Репрезентативні клінічні зображення ран. (B) Комп’ютеризовані вимірювання відкритої області рани проводили за допомогою ImageJ (n = 8 ран на день та група лікування). ** Р + фарбування) вимірювали за допомогою комп’ютеризованої морфометрії. Проаналізовано принаймні шість розділів для кожної групи лікування (n = 6). Наведені дані є середніми значеннями ± SE. * P ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ –31). СНР siRNA - це унікальні високоаніонні конструкції, які не потребують додаткових хімічних модифікацій для полегшення транспортування через роговий шар або проникнення в клітини. Було показано, що конструкції СНС є високоефективними і не виявляють очевидної токсичності в програмах регулювання генів in vivo (17, 18), в тому числі в цьому дослідженні з діабетичними мишами. Незважаючи на відсутність епідермального бар'єру на самій рані, неспроможність вільної мік-рани GM3S для поліпшення загоєння рани свідчить про те, що здатність GM3S СНР проходити через епідермальний бар'єр по краю рани і збивати свою мішень грає важливу роль у прискоренні Міграція та розповсюдження KC.