Шлях уживання фруктози кишковою паличкою із залученням регулятора фукози PNAS

Автор: Ганс Корнберг, 25 жовтня 2006 р. (Отримано на огляд 17 жовтня 2006 р.)

уживання

Анотація

Фруктоза може бути засвоєна кишковою паличкою за допомогою різноманітних мембранних білків, які розпізнають цукри з конфігурацією 3,4,5-d -арабіно-гексози. Тут ми описуємо мутанта, який позбавлений цих білків, але поглинає фруктозу через носій FucP, який зазвичай використовується для транспортування α-l-фукози; це означає, що фруктоза поглинається у формі α- або β-фруктопіранози. Для зростання асимільована фруктоза послідовно фосфорилюється АТФ та (i) манно (фрукто) кіназою, утворюючи фруктозу 6-фосфат та (ii) фосфофруктокіназу, утворюючи фруктозу 1,6-бісфосфат, який є членом центральних шляхів. гліколізу та глюконеогенезу. Мутація, яка надає організму здатність засвоювати фруктозу через регулятор фукози, була виявлена ​​як делеція гена fucA з подальшою індукцією протонно-зв'язаного транспортера фукози, FucP.

Раніше ми (1) описали властивості мутанта кишкової палички, позначеного HK 2148, який здатний рости на фруктозі як єдиному джерелі вуглецю, незважаючи на інактивацію всіх відомих шляхів, що включають систему фосфоенолпіруват/глікоза фосфотранферази (PT) для поглинання та використання цієї кетози (2). Вступ фруктози до цього штаму досягається за рахунок полегшеної дифузії через ізоформу нормально зв’язаного транспортера глюкози, PtsG, який, отже, вимагає забезпечення порівняно високих концентрацій фруктози в середовищі (км для зростання = ≈8 мМ) . Як і слід було очікувати від цього режиму засвоєння фруктози, ріст на цьому субстраті сильно пригнічується за допомогою аналогів глюкози, таких як метил-α-d -глюкозид (αMG). Однак культури HK 2148, випромінені протягом декількох днів при температурі від 37 ° до 20 мМ фруктози плюс 1 мМ αMG, дали початок подальшим мутантам, деякі з яких не тільки не пропускали наявність αMG при вирощуванні на фруктозі, але вирощували на цій кетозі в концентраціях набагато нижче (км для зростання 14 С] Фруктоза за HK 2298.

У той час як суспензії вирощеного на LB HK 2298 легко поглинали і включали 14 C з [14 C] фруктози при концентраціях до 0,1 мМ, подібні суспензії HK 2148 робили це лише в незначній мірі (дані не наведені). Ні PtsG, ні білки, зазначені пов'язаним з РТ фруктозним опероном, не брали участі в цьому поглинанні: похідне HK 2298, яке також несло ptsG: kanR (штам HK 2385), виросло на фруктозі і поглинало цю кетозу зі швидкістю, що не відрізняється від HK 2298, як і інші похідні HK 2298, що містять або fruA: kanR (штам HK 2578), або делецію, що охоплює промоторну область оперону фруктози, а також fruB і fruK (штам HK 2544).

Місцезнаходження гена, відповідального за поглинання фруктози.

Щоб уникнути можливих помилок через введення PT-зв’язаного фруктозного оперону, ряд штамів Hfr E. coli, що передають ДНК з різних точок походження та в різних напрямках та несуть транспон Tn10 у відомих місцях (3), схрещують із штамом HK 2578, похідна HK 2298, у якій активність FruA була видалена введенням fruA: kanR; всі екскон'юганти тестували на утримання маркера kanR. Ці стійкі до тетрацикліну колонії пройшли скринінг на предмет втрати здатності рости на 2,5 мМ фруктозі. Ми виявили, що штам Hfr BW6169, який несе argA: Tn10, розташований на хвилині 63,5 на карті зв'язку E. coli (4) і передає свою ДНК проти годинникової стрілки приблизно з хвилини 84,8, породив стійкі до тетрацикліну колонії, з яких 40% не вдалося виростити на фруктозі і яка також зайняла 0,5 мМ [14 С] фруктози лише за незначною швидкістю. Цей результат поставив передбачувану систему засвоєння фруктози в місці, близькому до argA. Це місце (5) було більш точно визначено трансдукцією HK 2578 з фагом, що несе fucP: Tn10, делецією гена, що визначає протонно-зв'язаний транспорт фукози, який знаходиться на рівні хв 63,2. Жоден із 116 отриманих трансдуктантів не виріс або не поглинув фруктозу.

Ідентичність системи поглинання фруктози з компонентом регулону фукози (6) досліджували за допомогою двох трансдуктантів argA: Tn10 від кросу [фаг P1, вирощений на BW6169 × HK 2578], один (HK 2621), який зберіг здатність до ростуть на фруктозі, а інший (HK 2622) - серед 40%, які її втратили. Ми спостерігали, що поглинання 0,5 мМ [14 С] фруктози вирощеним LB HK 2621 сильно інгібується 0,1 мМ-α- l - (-) - фукозою, але не d - (+) - фукозою (рис. 1А) . HK 2622 поглинав мічену фруктозу при l - (-) - фукозі (рис. 1B).

Вплив α- l -фукози на поглинання 0,5 мМ [14 С] фруктози. (A) Штам HK 2621 (Fuc-F +), що поглинає [14 C] фруктози окремо (○) та у присутності d - (+) - фукози (▴) або l - (-) - фукози (●) . (B) Штам HK 2622 (Fuc-F -), що поглинає [14 C] фруктози окремо (○) та у присутності l - (-) - фукози (●). Зверніть увагу на різницю в масштабі.

Крім того, суспензії вирощеного LB HK 2621 значною мірою поглинали α-l - [3 H] фукозу, тоді як подібні суспензії HK 2622 ні (рис. 2).

Поглинання 0,5 мМ [3 H] фукози штамом HK 2621 (Fuc-F +) (○) та штамом HK 2622 (Fuc-F -) (■).

Це поглинання HK 2621 (і його батьківської організації, HK 2578) відбулося швидко лише протягом перших декількох хвилин впливу ізотопу, а потім зросло лише незначною мірою, що вказувало на те, що поглинена фукоза не піддавалась подальшому метаболізму. Погоджуючись з цією інтерпретацією, ми спостерігали, що жоден штам, HK 2578 та HK 2621, не росли на α-l -фукозі, тоді як їхні фруктозонегативні батьки HK 2148 та HK 2632. Крім того, додавання 1 мМ-α-1 -фукози до культур HK 2578, що вирощують на 1–10 мМ фруктози, сильно перешкоджало зростанню, з кінетикою, що свідчить про конкурентне пригнічення (рис. 3); тоді як додавання α- l -фукози до культур HK 2632, що вирощують на 5–20 мМ фруктози, не мало такого ефекту (дані не наведені).