Стійка периферична експресія трансгенного адипонектину компенсує розвиток дієти

За редакцією Кеннета І. Бернса, Університет Флориди, Гейнсвілль, Флорида, та затверджено 17 вересня 2003 р. (Отримано на огляд 24 червня 2003 р.)

адипонектину

Анотація

Ожиріння, визнане Всесвітньою організацією охорони здоров'я проблемою охорони здоров'я пандемічних розмірів, є складним метаболічним розладом багатофакторної етіології, що часто призводить до інсулінорезистентності, дисліпідемії, гіпертонії, порушення фібринолізу та багатьох інших патологічних станів, включаючи рак (1) . У західних країнах 2–8% витрат на охорону здоров’я пов’язано з ожирінням (2), і ця статистика погіршується низьким рівнем успішного лікування. На сьогоднішній день ефективного фармакологічного лікування не встановлено, оскільки сучасні препарати проти ожиріння викликають безліч шкідливих побічних ефектів (3, 4).

Серед потенційних терапевтичних молекул лептин не виправдав очікувань як препарат вибору при ожирінні, спричиненому дієтою (DIO), оскільки переважна більшість пацієнтів із надмірною вагою є лептинорезистентними (5). При центральному введенні лептин спочатку опосередковував більш сильний анорексигенний ефект (6), але потім сприяв розвитку центральної резистентності до лептину в мозку щурів, підданому розширеній конститутивній експресії лептинового трансгену (7, 8).

Методи

Тварини та дієта. Догляд за щурами Спраг-Доулі (селекціонери Харлан, Індіанаполіс) здійснювався згідно з принципами Керівництва Національної дослідницької ради з догляду та використання лабораторних тварин (посилання 19; доступно за адресою: http://oacu.od.nih.gov /regs/guide/guidex.htm). Щурів утримували індивідуально при 23–24 ° C з циклом 12:12 год світло/темрява. Тварин годували ad libitum одним із наступних двох типів дієти, як зазначено: стандартна лабораторна чау (12% ккал у вигляді жиру; Лабораторна дієта, Сент-Луїс), надалі - нормальна дієта (НД) та висококалорійна дієта (60% ккал у вигляді жиру; Дієти досліджень, Нью-Брансвік, Нью-Джерсі), надалі - дієта з високим вмістом жиру (СН).

Вектор будівництва. кДНК, що кодує мишачий Acrp30, отримували шляхом RT-PCR-опосередкованого клонування з використанням загальної РНК, виділеної з білої жирової тканини. Під час перевірки послідовності була виявлена ​​одноточкова мутація (A 382/G), яка змінила Met-113/Val. КДНК використовували "як є", не повертаючи залишок назад до повідомленої послідовності (9), оскільки вирівнювання послідовності мишачого Acrp30 та людського apM1 (20) виявило наявність залишку Val у відповідному положенні ортолога людини, і мутація була визнана функціонально неактуальною. Вектор rAAV, що несе мишачу кДНК Acrp30, збирали за допомогою основи pTR-UF (21). TR-фланована касета експресії трансгену містила такі генетичні елементи: підсилювач цитомегаловірусу/промотор β-актину курки (22), кДНК Acrp30, посттранскрипційний елемент вірусу гепатиту вудчука (23) та сайт поліаденилування бичачого гормону.

Упаковка, титрування та адміністрування векторів rAAV. Переносна плазміда pTR-Acrp30, що містить експресійну касету Acrp30, була упакована в капсули серотипу AAV1 або AAV5. Серотипи 1 та 5 отримували за способом, відомим як «псевдотипування», використовуючи відповідні хелперні плазміди pXYZ1 або pXYZ5 (24), що містять гени капсидів AAV1 та AAV5, відповідно. Вектори упаковували, очищали, концентрували та титрували, як описано (24). Очищені rAAV-вектори мали чистоту> 99%, як вимірювали електрофорезом у поліакриламідному гелі та фарбуванням сріблом (дані не наведені). Середнє співвідношення фізичних та інфекційних частинок становило 50: 1.

Одноразову дозу вектора 10 резистентних до ДНКази I частинок на 500 мкл розчину Рінгера з лактатом вводили тваринам або шляхом ін’єкції у ворітну вену (PVI), або через ін’єкції в чотириголовий м’яз.

Гістологія. Щурів вбивали при передозуванні пентобарбіталом і збирали сироватку. Усю печінку зібрали і зважили. Невелику порцію поміщали в розчин РНК-пізніше (Ambion, Austin, TX). Зрізи печінки, підшлункової залози, жирової тканини та м’язів збирали для рутинної гістопатологічної оцінки. Зразки тканин фіксували на ніч у 10% нейтральному буферизованому формаліні та вкладали у парафін. Парафінові зрізи (товщиною 5 мкм) фарбували гематоксиліном та еозином та досліджували на наявність запальних або дегенеративних змін патологоанатомом, який не знав про групу лікування тварин.

Плазма Acrp30, лептин та глюкоза. Плазму Acrp30 вимірювали за допомогою наборів Acrp30 RIA для мишей та щурів (Linco Research Immunoassay, St. Charles, MO) або ELISA (B-Bridge International, Саннівейл, Каліфорнія). В якості альтернативи миші Acrp30 аналізували, використовуючи Вестерн-блот-аналіз (див. Нижче). Плазмовий лептин вимірювали за допомогою набору ендокринних панелей щурів LINCOplex (Linco Research Immunoassay).

i.p. Тест на толерантність до глюкози (IP GTT). IP GTT проводили на 27 тижні після введення вектора. Після нічної 17-годинної швидкої, знеболеної щурам вводили внутрішньовенно. з дозою 1,5 г 50% розчину глюкози на кг маси тіла (БТ). Зразки крові отримували з хвостової вени до зараження глюкозою та через 15, 30, 60, 90 та 120 хв після глюкози. Концентрацію глюкози в крові вимірювали за допомогою портативного глюкометра Elite XL (Bayer, Elkhart, IN).

Виділення РНК. Загальну РНК з печінки виділяли за допомогою реагенту TRIzol (GIBCO/BRL). Цілісність РНК перевіряли методом денатурації агарозного гелю (1%) електрофорезом з фарбуванням броміду етидію.

Вплив периферично введеного rAAV1-Acrp30 або rAAV5-Acrp30 на самках щурів DIO. Усі ін’єкції, якщо не вказано інше, робили внутрішньопортально. (A) Зміна BW. (B) Середньодобова FI, показана для всіх груп. Як зазначено, дві групи демонструють значну різницю. (C) Зміна споживаної ккал/добу. Для наочності показані лише дві групи щурів. (D) Середнє добове споживання калорій, показане для всіх груп. (E) Рівень лептину в плазмі на момент вбивства тварин. NS, не є статистично значущим. (F) Ділянка ефективності корму (FE), як пояснюється в результатах. □, контрольним щурам DIO, яким вводили вектор rAAV-GFP (n = 10) і годували HF; Control, контрольним щурам, яким вводили вектор rAAV-GFP (n = 6) і годували ND; • щурам вводили внутрішньом’язово вектор rAAV1-Acrp30 (n = 6) і годували HF; ▴, щурам, яким вводили вектор rAAV1-Acrp30 (n = 6) і годували HF; ♦, щурам вводили вектор rAAV5-Acrp30 (n = 6) і годували HF. Збільшення споживання їжі та калорій, задокументоване на початку експерименту (С), пояснюється переходом на СН, який є більш смачним. Стрілки на A та C вказують час, коли проводився IP GTT.

Вестерн-блот-аналіз білків у плазмі щурів, яким вводили rAAV1-Acrp30 або rAAV5-Acrp30. (А) Плазма щурів на 40 день після обробки. (B) Плазма від щурів, убитих на 297 день після лікування. (C) Те саме, що і B, за винятком розведеного 1: 100 і гібридизованого до специфічних для щурів антитіл проти Acrp30. Плазму нормальної миші використовували як позитивний контрольний зразок (розведення 1: 100 або 1: 200). Цифри над кожною смугою стосуються окремих експериментальних тварин. (D) SDS/4–15% PAGE електрофорез з подальшим імуноблотингом. Перед завантаженням попередньо очищену плазму одного з щурів rAAV5-Acrp30 обробляли або в умовах зменшення (+), або в режимі невідновлення (-). Розведену плазму миші, яка використовувалась як позитивний контроль, обробляли таким же чином. Висока концентрація білків у нерозбавлених зразках щурів у невідновлюваних умовах призвела до дефектної рухливості мультимерних комплексів; HMW, висока молекулярна маса; MMW, середня молекулярна маса; НМГ, низькомолекулярний вага (24).