Структура метилювання ДНК у жінок із зайвою вагою при дієті з обмеженим енергоспоживанням, доповненою рибою
1 Департамент харчування, харчових наук та фізіології, Університет Наварри, C/Irunlarrea 1, 31008 Памплона, Іспанія
2 Кафедра фізіології та біофізики, Інститут біомедичних наук, Університет Сан-Паулу, проспект професора Лінеу Престес, 1524, 05508-900 Сан-Паулу, Іспанія, Бразилія
3 CIBER Fisiopatología de la Obesidad y la Nutrición (CIBERobn), Instituto de Salud Carlos III, 28029 Мадрид, Іспанія
Анотація
1. Вступ
Отже, метою цього дослідження було перевірити гіпотезу, чи впливає добавка риб'ячого жиру в рамках дієтичного режиму з обмеженим використанням енергії на схему метилювання ДНК генів, які регулюються -3 Добавки PUFA в PBMC, такі як рецептори жирних кислот CD36 і FFAR3, ферменти FADS1 і PDK4, і поверхневий антиген CD14.
2. Методи
2.1. Дизайн випробувань та учасники
Первинне дослідження базувалося на рандомізованому 8-тижневому дослідницькому дослідженні чотирьох ізокалорійних дієт, призначеного для вивчення специфічних наслідків споживання риби або добавок риб’ячого жиру на втрату ваги у молодих дорослих із надмірною вагою (реєстрація дослідження: ClinicalTrials.gov NCT00315770) [18 ]. У цьому клінічному дослідженні загалом було включено 324 особи з надмірною вагою (140 з Ісландії, 120 з Іспанії та 64 з Ірландії) і випадковим чином розподілені до чотирьох дієтичних груп (капсули контролю, тріски, лосося та риб'ячого жиру) [18]. Детальний опис протоколу, набір та зарахування учасників, критерії включення та виключення описані в інших місцях [18, 19]. Коротко кажучи, початковими критеріями включення були індекс маси тіла (ІМТ) 27,5–32,5 кг/м 2, вік від 20 до 40 років та обхват талії ≥94 см та ≥80 см для чоловіків та жінок відповідно. Критеріями виключення були зміни ваги через дієту для схуднення протягом 3 місяців до початку дослідження, використання добавок, що містять -3 жирні кислоти, кальцій або вітамін D протягом останніх 3 місяців, медикаментозне лікування цукрового діабету, гіпертонії або гіперліпідемії, а також вагітність або лактація жінок.
). Щоб зменшити мінливість, суб'єкти, що належать до груп тріски та лосося, не аналізувались, оскільки якби в цих групах спостерігалися зміни метилювання ДНК, було б неможливо знайти відповідальних агентів через великі відмінності в макроелементах та мікроелементах між обома видами риб. Дослідження було схвалено Етичним комітетом Університету Наварри та відповідало рекомендаціям Гельсінкі. Усі учасники дали свою письмову згоду після того, як були проінформовані про природу мети та можливі ризики дослідження. Це дослідження було проведено в Університеті Наварри в Памплоні, Іспанія, і набір проводився протягом 2004 та 2005 років.
2.2. Дієтичне втручання
2.3. Антропометричні та метаболічні вимірювання
Вимірювання антропометричних параметрів та відбір зразків крові проводили на початковому рівні та після періоду добавки (кінцевої точки), як описано раніше [24]. Рівні глюкози, загального холестерину та триацилгліцеринів у плазмі крові вимірювали за допомогою специфічних колориметричних аналізів (Horiba ABX Diagnostics, Монпельє, Франція) з використанням автоматичної системи (COBAS MIRA, Рош, Базель, Швейцарія), тоді як рівні інсуліну в крові визначали методом ІФА (Mercodia)., AB, Уппсала, Швеція). Індекс оцінки моделі гомеостазу (HOMA-IR) розраховували згідно з Matthews et al. [25] з метою оцінки резистентності до інсуліну.
2.4. Виділення PBMC, вилучення ДНК та перетворення бісульфіту
PBMC виділяли диференціальним центрифугуванням із застосуванням Polymorphprep (Axis Shield PoC AS, Осло, Норвегія), як було описано раніше [26], і зберігали при -80 ° C. ДНК екстрагували за допомогою набору AllPrep DNA/RNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Німеччина). Концентрацію ДНК визначали кількісно за допомогою набору для аналізу dsDNA Quant-iT PicoGreen (Invitrogen, Карлсбад, Каліфорнія, США) та геномної ДНК (2 μg) було перетворено бісульфіт за допомогою набору EpiTect Bisulfite Kit (Qiagen, Валенсія, Каліфорнія, США).
2.5. Профіль метилювання визначається за допомогою мас-спектрометрії MALDI-TOF
Профілі метилювання ДНК п’яти генів аналізували в PBMC: CD36, CD14, FADS1, PDK4, і FFAR3. Вивчені геномні послідовності наведені в таблиці 1S у додаткових матеріалах, доступних в Інтернеті за адресою http://dx.doi.org/10.1155/2014/675021.
По-перше, регіон, що охоплює 3 кб (2000 пар базових вище за течією до 1000 базових пар нижче за течією від стартового місця транскрипції), був обраний з банку генів (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene) для кожного гена. Острови CpG були ідентифіковані за допомогою програмного забезпечення MethPrimer (http://www.urogene.org/methprimer/) [27]. Тоді як три гени показали CpG-острови (CD14, PDK4, і FADS1), ні FFAR3 ні CD36 показали ці багаті на CpG динуклеотиди регіони. Прогнозовані сайти зв'язування факторів транскрипції були ідентифіковані за допомогою програмного забезпечення AliBaba2 (http://www.gene-regulation.com/pub/programs/alibaba2/index.html) з гомологією 75%. Потім для кожного гена було вибрано область від 300 до 500 п.н. на острові CpG та/або багату передбачуваними факторами транскрипції (табл. 1). Профіль метилювання цих генів був визначений за допомогою технології MassARRAY EpiTyper Sequenom (Sequenom, Сан-Дієго, Каліфорнія, США), яка спирається на специфічне для розщеплення підставу з подальшою масовою спектрометрією MALDI-TOF, як описано раніше [28]. Використані праймери наведені в таблиці 1. Значення метилювання ДНК деяких сайтів CpG не можна виміряти незалежно. Це випадок із сусідніми сайтами CpG та сайтами CpG, включеними до подібних хімічних фрагментів після ферментативного розпаду. Отже, вони були об’єднані в групи та розглядались як незалежний сайт CpG при аналізі.