Техніка поліморфізму довжини фрагмента обмеження (RFLP); Новини-Медичні
Поліморфізм довжини фрагмента обмеження (RFLP) - це техніка, винайдена в 1984 році англійським ученим Алеком Джеффрісом під час досліджень спадкових захворювань. Він використовується для аналізу унікальних закономірностей у фрагментах ДНК з метою генетичної диференціації організмів - ці моделі називаються змінною кількістю тандемних повторень (VNTR).
Генетичний поліморфізм визначається як успадковані генетичні відмінності серед особин у понад 1% нормальної популяції. Техніка RFLP використовує ці відмінності у послідовностях ДНК для розпізнавання та вивчення як внутрішньовидових, так і міжвидових варіацій.
Принцип
Ендонуклеази обмеження - це ферменти, які розрізають довгу ДНК на короткі шматочки. Кожна рестрикційна ендонуклеаза націлена на різні послідовності нуклеотидів у ланцюзі ДНК і, отже, розрізається на різних ділянках.
Відстань між місцями розщеплення певної ендонуклеази рестрикції відрізняється у особин. Отже, довжина фрагментів ДНК, утворених рестрикційною ендонуклеазою, буде різнитися як у окремих організмів, так і у видів.
Як це працює?
RFLP виконується з використанням ряду кроків, коротко описаних нижче:
Вилучення ДНК
Для початку ДНК виділяють із крові, слини або інших зразків та очищають.
Фрагментація ДНК
Очищена ДНК засвоюється за допомогою рестрикційних ендонуклеаз. Сайти розпізнавання цих ферментів, як правило, мають довжину від 4 до 6 пар основ. Чим коротша розпізнана послідовність, тим більша кількість фрагментів утворюється в результаті перетравлення.
Наприклад, якщо існує коротка послідовність GAGC, яка повторюється у зразку ДНК. Ендонуклеаза рестрикції, яка розпізнає послідовність GAGC, розрізає ДНК при кожному повторенні моделі GAGC.
Якщо одна проба повторює послідовність GAGC 4 рази, тоді як інша проба повторює її 2 рази, довжина фрагментів, що генеруються ферментом для двох зразків, буде різною.
Гель-електрофорез
Фрагменти рестрикції, що утворюються під час фрагментації ДНК, аналізують за допомогою гель-електрофорезу.
Фрагменти заряджені негативно і можуть бути легко розділені за допомогою електрофорезу, який розділяє молекули залежно від їх розміру та заряду. Фрагментовані зразки ДНК поміщають у камеру, що містить електрофоретичний гель та два електроди.
При застосуванні електричного поля фрагменти мігрують у бік позитивного електрода. Менші фрагменти швидше рухаються через гель, залишаючи за собою більші, і таким чином зразки ДНК поділяються на окремі смуги на гелі.