Терапевтична ефективність трансгенного низькоалкалоїдного тютюну, що експресує організм людини

Південний центр захисту рослинництва та досліджень продуктів харчування, сільське господарство та сільськогосподарська їжа Канади, вул. Сандфорд 1391, Лондон, Онтаріо, Канада, N5V 4T3

Інститут досліджень охорони здоров’я Лоусона, Лондон, США, Канада, N6A 5A5

Науково-дослідний інститут Робертса, Лондон, Онтаріо, Канада, N6A 5A5

Інститут досліджень охорони здоров’я Лоусона, Лондон, США, Канада, N6A 5A5

Plantigen Inc., 700 Collip Circle, Лондон, Онтаріо, Канада, N6G 4X8

Санібрук та Жіночий коледж Науковий центр охорони здоров'я, 2075 Bayview Avenue, кімната A338, Торонто, Онтаріо, Канада, M4N 3M5

Інститут досліджень охорони здоров’я Лоусона, Лондон, США, Канада, N6A 5A5

Науково-дослідний інститут Робертса, Лондон, Онтаріо, Канада, N6A 5A5

Інститут досліджень охорони здоров’я Лоусона, Лондон, США, Канада, N6A 5A5

Науково-дослідний інститут Робертса, Лондон, Онтаріо, Канада, N6A 5A5

Інститут досліджень охорони здоров’я Лоусона, Лондон, США, Канада, N6A 5A5

Plantigen Inc., 700 Collip Circle, Лондон, Онтаріо, Канада, N6G 4X8

Санібрук і Жіночий коледж Науковий центр охорони здоров'я, 2075 Bayview Avenue, кімната A338, Торонто, Онтаріо, Канада, M4N 3M5

Південний центр захисту рослин та харчових продуктів, Сільське господарство та сільськогосподарська їжа Канади, 1391 Sandford St., Лондон, Онтаріо, Канада, N5V 4T3

Інститут досліджень охорони здоров’я Лоусона, Лондон, США, Канада, N6A 5A5

Науково-дослідний інститут Робертса, Лондон, Онтаріо, Канада, N6A 5A5

Резюме

Вступ

Спочатку описаний у 1989 р. (Fiorentino та ін., 1989), численні дослідження показали, що IL-10 є потужним протизапальним цитокіном завдяки своїй здатності інгібувати активацію макрофагів і Т-хелпер-1 (Th1) Т-клітин, а також експресію TNF-α ( Вієйра та ін., 1991; Кун та ін., 1993; Шрайбер та ін., 1995). Незважаючи на те, що системне введення IL-10 показало очевидну користь для стійких до стероїдів CD та UC, на жаль, у довгострокових дослідженнях клінічна користь та ендоскопічне поліпшення запалення кишечника у пацієнтів з помірно активним та хронічним активним CD були компенсовані шкідливим впливом на рівень еритроцитів і тромбоцитів, які, ймовірно, були пов’язані із системним (підшкірним) введенням більш високих доз IL ‐ 10 (> 10 мкг/кг) (Schreiber та ін., 2000). Щоб уникнути токсичності, пов’язаної із системним введенням, Steidler та ін. (2000) використовували внутрішньошлунковий прийом Lactococcus lactis секрецію IL-10 для зменшення запалення в IL-10 -/- та декстрансульфат натрію (DSS) мишачих моделей коліту. У подальших дослідженнях тимідин-залежний штам Лактокок був використаний для вирішення питань біобезпеки та потенційних втеч модифікованих організмів в навколишнє середовище (Steidler та ін., 2003).

Результати і обговорення

Експресований рослиною IL-10 не глікозильований

Рослинний рекомбінантний людський інтерлейкін-10 (pIL-10) не глікозильований. Рекомбінантний IL-10 (rIL-10), pIL-10 та рекомбінантний еритропоетин (rEPO) обробляли в буфері деглікозилювання протягом 2 годин при 37 ° C з або без PNGase F. Доріжка 1, rIL-10; доріжка 2, rIL ‐ 10 з PNGase F; доріжка 3, pIL ‐ 10; провулок 4, pIL ‐ 10 з PNGase F; доріжка 5, rEPO; доріжка 6, rEPO з PNGase F.

Експресований рослиною IL-10 стійкий до перетравлення шлункової та кишкової рідини

Очищений білок IL-10 є кислотонестійким і швидко руйнується в умовах низького рН (Syto та ін., 1998). Оскільки ми мали намір доставити rIL ‐ 10, експресований в рослинній тканині, як харчову добавку, критично важливо було визначити, чи стійкий pIL ‐ 10 до деградації шлунково-кишкового тракту, і чи сприяє рослинний клітинний матрикс будь-якому захисту від ферментів та Умови рН. В пробірці дослідження з модельованими розчинами травлення широко використовуються як моделі травлення тварин для дослідження контрольованого вивільнення експериментальних фармацевтичних препаратів (Доерті та ін., 1991), а також засвоюваність рослинних і тваринних білків та харчових добавок (Zikakis та ін., 1977; Тільч та Еліас, 1984). Тому ми порівняли стабільність hIL ‐ 10, виробленого в трансгенних рослинах, або вбудованому в ліофілізовану тютюнову тканину, або очищеному з рослинної тканини, використовуючи змодельовану шлункову рідину (SGF, 3,2 г/л пепсину, рН 1,2) для моделювання стану шлунку та імітація кишкової рідини (SIF, 10 г/л панкреатину, рН 6,8) для проксимальних станів тонкої кишки. Усі експерименти з травлення проводились з нативними димерними білками rIL ‐ 10 та pIL ‐ 10, для яких раніше було доведено, що є біологічно активними (Menassa та ін., 2001).

За відсутності рослинного матеріалу очищений рослинний рекомбінантний людський інтерлейкін-10 (pIL-10) порівнювали з рекомбінантним IL-10 (rIL-10). IL-10 було виявлено імуноблотінгом після перетравлення rIL-10 (a, c) та pIL-10 (b, d) в імітованій шлунковій рідині (SGF) при кислому (a, b) та нейтральному (c, d) pH. Заповнені зірки позначають мономер IL-10; відкриті зірки позначають димер IL ‐ 10. pIL ‐ 10 трохи більше, ніж rIL ‐ 10 через C ‐ кінцеву мітку (Menassa та ін., 2001).

Виявлення інтерлейкіну-10 (IL-10) за допомогою імуноферментного аналізу (ІФА). (a) Лікування ліофілізованого листя в імітованій шлунковій рідині (SGF) при нейтральному або кислому рН. (b) Лікування очищеного рекомбінантного IL-10 (rIL-10), рослинних рекомбінантних людських IL-10 (pIL-10) або ліофілізованих листя, що експресують IL-10, у імітованій кишковій рідині (SIF).

Миші добре переносять хронічне пероральне вживання тютюну з низьким вмістом нікотину

Було показано, що нікотин впливає на запалення як у пацієнтів з UC, так і у CD (Birrenbach and Bocker, 2004). Хоча нікотин негативно впливає на єюніт, він, як видається, покращує коліт у мишей IL-10 -/-, вказуючи на наявність безпосереднього впливу нікотину на імунну систему (Еліакім та ін., 2001). Тому було важливо забезпечити, щоб вплив навіть невеликих кількостей нікотину в тютюні з низьким вмістом алкалоїдів не змішував спостереження у мишей, яких годували тютюновою тканиною. Тютюн з низьким вмістом алкалоїдів, вирощений у камерах із контрольованим середовищем, містив від 1,5 до 3,1 мкг нікотину/г сухої маси (РГ) (Таблиця 1). Розрахована максимальна експозиція менше 6 мкг на день була значно нижчою за рівні експозиції 75 мкг на день, що мало ефект на мишей IL-10 -/- (Eliakim та ін., 2002). Відповідно до цього, не було різниці в будь-якому клінічному параметрі, прирості ваги або гістології кишечника у мишей, яким давали лише рослинні тканини тютюну з низьким вмістом нікотину порівняно з тими, хто отримував нормальну чау (не показано).

Нульовий фон миші IL ‐ 10 Кількість мишей/групи Тютюн у раціоні (%) Вміст нікотину Концентрація IL ‐ 10 (мкг/г СЗ) Нетрансформований (мкг/г DW) IL ‐ 10 (мкг/г DW)

Випробування 1	C57BL/6	8	20	2.9	5.2	2.68
Випробування 2	C3H	8	20	3.1	2	4.5
Випробування 3	C3H	5 (контроль), 10 (група IL-10)	30	1.5	1.4	6

* Мінливість вмісту нікотину та IL-10 є результатом різниці в умовах росту різних партій, тобто різних камер росту, різного віку рослин під час збору врожаю.