Тіопролін пригнічує розвиток аденокарциноми стравоходу, індуковану гастродуоденальним рефлюксом у

Хітомі Кумагай, Кен-Ічі Мукайшо, Хіроюкі Сугіхара, Коічі Міва, Гаку Ямамото, Таканорі Хатторі, Тіопролін пригнічує розвиток аденокарциноми стравоходу, викликаної гастродуоденальним рефлюксом у щурів, Канцерогенез, том 25, випуск 5, травень 2007, сторінка 5: //doi.org/10.1093/carcin/bgh067

Анотація

Кілька епідеміологічних когортних досліджень припустили, що дуодено-гастроезофагеальний рефлюкс сам по собі індукує стравохід Барретта, що призводить до підвищеного ризику розвитку аденокарциноми стравоходу (EAC). Однак точні причинні фактори, що стоять за EAC, залишаються незрозумілими. Нещодавно ми розробили нову модель рефлюксу вмісту дванадцятипалої кишки, яка зберігала нормальну роботу шлунка. У цій моделі вміст дванадцятипалої кишки повернувся назад у стравохід і шлунок, що призвело до повторного повторного потрапляння в стравохід через місце езофагоєюностомії. Для з'ясування факторів, що лежать в основі розвитку ЕАК, до нових моделей рефлюксу застосовували тіазолідин-4-карбонову кислоту (тіопролін, TPRO) як поглинач нітритів та як зонд для виявлення активних видів азоту (РНС). Після операції 31 тварина була розділена на дві групи відповідно до дієти. Тваринам, що належали до контрольної групи, давали нормальний раціон (n = 18), тоді як групі TPRO давали їжу, що містить 0,5% TPRO (n = 13). Всі зрізи стравоходу в обох групах досліджували за допомогою фарбування гематоксиліном та еозином та імуногістохімічного аналізу індуцибельної синтази оксиду азоту (iNOS). ЕАК розвивались у 7 з 18 щурів (38,9%) контрольної групи, тоді як у групі TPRO не виявляли ЕАК (точний тест Фішера, Р

Вступ

Гастроезофагеальна рефлюксна хвороба (ГЕРХ) за останні десятиліття стала поширеним захворюванням у США та Західній Європі (1, 2). Стравохід Барретта (BE) був пов'язаний із істотно підвищеним ризиком аденокарциноми стравоходу (EAC) і вважався наслідком тривалої кислотної травми (3 - 6). Однак було виявлено, що у великої популяції пацієнтів з ВЕ спостерігаються періоди не тільки шлункової кислоти, але й опромінення стравоходу дванадцятипалої кишки (7 - 12). І навпаки, кілька дослідників повідомляли, що дуодено-гастроезофагеальний рефлюкс сам по собі може спонукати BE до утворення EAC у щурів (13 - 15).

Щоб з'ясувати канцерогенні ефекти вмісту дванадцятипалої кишки, багато дослідників зверталися до факторів жовчних кислот і панкреатичного соку (16, 17), а інші посилалися на наявність бактеріальної флори в соку дванадцятипалої кишки, здатної каталізувати ендогенні реакції з утворенням нітрозосполук ( 18, 19). Нещодавно було зареєстровано надмірну експресію білка індукованої оксиду азоту синтази (iNOS) у карциномі стравоходу людей та тварин (20 - 22) та активних азотних формах (RNS), таких як оксид азоту (NO), пероксинітрит (ONOO -) та нітрозосполуки пропонується відігравати важливу роль у процесі неопластичної трансформації стравоходу.

Тіазолідин-4-карбонова кислота (тіопролін, TPRO) є циклічною сірковмісною амінокислотою і є продуктом конденсації цистеїну та формальдегіду (23, 24). TPRO є ефективним агентом, що затримує нітрити, як in vitro, так і в організмі людини, і є дуже чутливим зондом для оцінки здатності до нітрозування (25 - 27). Якщо РНС при гастродуоденальному рефлюксі або нітрозативні пошкодження сприяють канцерогенезу стравоходу, TPRO як поглинач нітритів може інгібувати розвиток ЕАК.

Нещодавно ми розробили нову модель рефлюксу вмісту дванадцятипалої кишки, яка зберігала нормальну роботу шлунка (15). Модель демонструє схожість із ситуацією у пацієнтів з дуодено-гастроезофагеальним рефлюксом, викликаючи як вміст дванадцятипалої кишки, так і рефлюкс шлункового соку в стравохід. Для з'ясування причинних факторів, що лежать в основі ЕАЦ, ми дослідили, чи може TPRO інгібувати ЕАС, викликаний дуодено-шлунково-стравохідним рефлюксом, використовуючи цю нову модель щурів.

Матеріали і методи

Тварина модель

Хірургічна процедура рефлюксу шлункового та дуоденального вмісту. Т, зв’язка Трейца. Однією з переваг цієї моделі в порівнянні з іншими моделями є нормальна робота шлунка та збереження нормального харчового статусу. Вміст дванадцятипалої кишки неодноразово надходить назад у стравохід і шлунок через місце езофагоєюностомії.

Гістологічне дослідження

Відразу після смерті видалили весь стравохід, ділянку анастомозу та тонку кишку довжиною 5 мм. Стравохід поздовжньо розкривали, розкладали на пробковій пластині слизовою стороною догори для макроскопічного дослідження, а потім фіксували у 10% нейтральному буферизованому формаліні у забуференному фосфатом сольовому розчині. Через 4 год фіксації видалену тканину розрізали послідовно на зрізи 3 мм уздовж поздовжньої осі. З кожної проби стравоходу було зроблено три зрізи. Зрізи вбудовували в парафін і розрізали на ділянки 4 мкм. Всі зрізи фарбували гематоксиліном та еозином (ВІН).

Важкий езофагіт характеризувався як гіперпластичний, коли плоский епітелій потовщувався при нормальному дозріванні та гіперкератозі, або регенеративний, коли плоский епітелій виявляв збільшену висоту соскових пластинок пластинки та гіперплазію базальноклітинних клітин (28). BE, плоскоклітинна дисплазія, аденосквамозна карцинома, EAC та плоскоклітинний рак стравоходу (ESCC) класифікували за класифікацією ВООЗ (29). Ми досліджували всю довжину стравоходу у всіх випадках. Якщо деякі ураження, згадані вище, були частково виявлені, ми зарахували їх як позитивні випадки.

Імуногістохімічний аналіз на iNOS

Серійні зрізи фарбування ВІН депарафінізували, а активність ендогенної пероксидази гасили інкубацією в 0,3% H 2 O 2 в метанолі протягом 30 хв при кімнатній температурі. Потім зрізи мікрохвилювали в цитратному буфері, рН 6,1, протягом 40 хв для отримання антигену. Неспецифічне зв'язування блокували 10% кролячої сироватки протягом 10 хв. Після блокування зрізи інкубували з мишачими моноклональними антитілами до iNOS (NOS2, C-11, розведення 1: 100; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) протягом ночі при 4 ° C. Нормальний мишачий IgG служив негативним контролем. Наступного дня імунореактивність була виявлена шляхом інкубації з біотинільованим кролячим анти-мишачим антитілом та стрептавідин-біотин-пероксидазним комплексом [Histofine SAB-PO (M) Kit; Нічірей, Токіо, Японія], по 20 хв. Потім колір розробляли з використанням 3,3′-діамінобензидину. Ядра були злегка забруднені гематоксиліном.

Статистичний аналіз

Статистичну оцінку проводили за допомогою точного критерію Фішера. Значення P Таблиця I. Важкий езофагіт з базаліозною гіперплазією був виявлений у всіх щурів контрольної групи. Тяжка дисплазія стравоходу (66,7%), виразка стравоходу (83,3%), спеціалізований колоноподібний епітелій BE (77,8%) (малюнок 2A), EAC (38,9%) (малюнок 2B), аденосквамозна карцинома (16,7%) (малюнок 2C) та ESCC (5,6%) (Малюнок 2D) також спостерігалися у контрольній групі. Майже всі ці ураження були виявлені в групі TPRO. Хоча езофагіт був виявлений у трьох щурів групи TPRO, ступінь запалення був незначним порівняно з контрольною групою. Важкий езофагіт розвинувся у всіх інших щурів групи TPRO. EAC та аденосквамозні карциноми не спостерігались у групі TPRO, а частота виразки стравоходу та EAC була значно меншою у групі TPRO, ніж у контрольній групі (P Таблиця I.