Тиреоїдит Хашимото погіршує імплантацію ембріонів, порушуючи морфологію ендометрію та
Анотація
Передумови
Хоча вважається, що дисфункція щитовидної залози, спричинена тиреоїдитом Хашимото (ХТ), пов’язана з відмовою імплантації через недорозвинення сприйнятливої матки, невідомо, чи пошкоджує сама ХТ навіть у еутиреоїдному стані імплантацію ембріонів, пов’язану з дефектами сприйнятливості ендометрія. Для вирішення питання, чи може сам НТ впливати на сприйнятливість ендометрія, що супроводжується змінами імплантації, у мишей була встановлена модель еутиреоїдної НТ.
Методи
Самки мишей NOD двічі імунізували тиреоглобуліном та ад'ювантом для індукції експериментальної моделі НТ. Через чотири тижні після другої обробки мишей нормально спарювали, а вагітних жертвували у вікні імплантації для вимірювання параметрів щитовидної залози та стероїдних гормонів за допомогою електрохімілюмінесцентного імунологічного аналізу та імуноферментного аналізу та обчислення кількості місць імплантації шляхом поглинання барвника Chicago Blue . Крім того, певні морфологічні особливості сприйнятливості ендометрія спостерігали за допомогою фарбування гематоксилін-еозином та скануючої електронної мікроскопії, а експресію інших маркерів сприйнятливості аналізували за допомогою імуногістохімії, RT-qPCR або Western Blot.
Результати
Миші HT виявляли внутрішньотиреоїдну інфільтрацію моноцитів та підвищений рівень аутоантитіл до щитовидної залози без дисфункції щитовидної залози, що визначається як HT еутиреозу у людей. Еутиреоїдна НТ призвела до невдалої імплантації, зменшення кількості піноподів, відсталого дозрівання піноподів та пригнічення експресії маркерів сприйнятливості: рецептора естрогену α (ERα), інтегрину β3, фактора, що інгібує лейкемію (LIF), та молекули адгезії клітини-1 (ICAM-1). Цікаво, що, незважаючи на цю компрометовану реакцію сприйнятливості ендометрія, статистичних відмінностей у рівнях естрадіолу та прогестерону в сироватці крові між групами не виявлено.
Висновки
Ці висновки першими вказують на те, що ГТ індукує нерецептивне середовище ендометрія в еутиреоїдному стані, що може лежати в основі згубного впливу самого ГТ на імплантацію ембріонів.
Вступ
Для перевірки цієї гіпотези в цьому дослідженні побудована класична модель миші НТ [28], в якій самок мишей NOD активно імунізували свинячим тиреоглобуліном (pTg) і досліджували, чи змогла сама НТ вплинути на морфологію ендометрію та молекулярну експресію ендометрія гени, пов’язані зі сприйнятливістю, що супроводжуються компрометованою імплантацією ембріона у вікні імплантації.
Матеріали і методи
Реактиви та хімічні речовини
Свинячий тиреоглобулін (pTg), повний ад’ювант Фрейнда (CFA) та неповний ад’ювант Фрейнда (IFA) були від Sigma Chemical Co. (Сент-Луїс, Міссурі, США). Набір TSH ELISA був від Cloud-Clone Corp. (Ухань, Хубей, Китай). Набори E2 та P ELISA були від Cusabio Biotech Co., Ltd. (Ухань, Хубей, Китай). Комплект виявлення SPlink був від ZSGB-Bio (Пекін, Китай). Антитіла до рецепторів естрогену α, інтегрину β3 та GAPDH були від Abcam (Кембридж, штат Массачусетс, США). Антитіла до рецепторів прогестерону, LIF, ICAM-1 були від компанії Bioss, Inc. (Пекін, Китай). Реагент TRI був отриманий від Molecular Research Center, Inc. (Цинциннаті, Огайо, США). Набори без дезоксирибонуклеази, що не містять рибонуклеази (ДНКаза, що не містить РНКази), та набори зворотної транскрипції (RT) у режимі реального часу отримували від Promega Corporation (Медісон, Вісконсин, США). Light Cycler® 480 SYBR Green I Master Mix від Roche Diagnostics GmbH (Базель, Швейцарія). Всі інші реагенти були придбані у Sigma або як зазначено в Методах.
Тварини
Миші NOD (4 тижні, самки мишей: 10
13 г; самці мишей: 12
16 г) були придбані у Нанкінському біомедичному дослідницькому інституті Нанкінського університету (номер дозволу: 15–0001). Після 7 днів карантину всіх мишей утримували у специфічних умовах, вільних від патогенів, з вільним доступом до води та їжі в лабораторному центрі тварин Медуніверситету Аньхоя (номер дозволу: 17–006). Всі процедури на тваринах проводили відповідно до керівних принципів, встановлених Центром лабораторних наук про тварин та Асоціацією лабораторних наук про тварин при Медичному університеті Аньхої.
Імунізація та експериментальне проектування
Електрохімілюмінесцентний імуноаналіз (ECLIA)
Усі зразки сироватки та тканини зберігали при - 80 ° C до використання. Крім того, тканини ендометрію гомогенізували в 10 мкл/мг PBS, а потім супернатанти збирали центрифугуванням при 15000 × g протягом 15 хв при 4 ° C. Концентрації вільного трийодтироніну (FT3), вільного тетрайодтироніну (FT4), TPO-Ab та Tg-Ab у сироватці та супернатантах гомогенату ендометрія визначали за допомогою електрохімілюмінесцентного імунологічного аналізу (ECLIA) за допомогою аналізатора клінічної хімії Cobas e411 (Roche, Mannheim, Німеччина) . Набори безкоштовного трийодтироніну, FT4, TPO-Ab та Tg-Ab ECLIA були придбані у компанії Roche Applied Science. Процедури для ECLIA були докладно описані в інших місцях [29]. Результати визначали за допомогою калібрувальної кривої, яка була спеціально створена приладом за допомогою двоточкового калібрування, та головної кривої, наданої через штрих-код реагенту. Дані виражаються як міжнародні одиниці пікомолярів на грам гормону та на міліграм білка тканини ендометрія. Усі зразки проводили у двох примірниках, а середнє значення використовували як остаточне значення аналізу для кожного зразка. Коефіцієнти варіації для аналізів цих профілів щитовидної залози становили від 7,38 до 14,22%.
Імуноферментний аналіз (ІФА)
Решту зразків сироватки розморожували до кімнатної температури (18–25 ° C) для визначення кількості ТТГ, Е2 та Р кожного місяця, використовуючи їх відповідні набори ІФА згідно з інструкціями виробника. Для значення оптичної щільності (OD) поглинання кольору в пластинах вимірювали при 450 нм за допомогою зчитувача BioTek (Biotek Winooski, Вермонт, США). Дані виражаються як пікограми або нанограми на мілілітр гормону сироватки. Всі зразки проводили у двох примірниках, а середнє значення використовували як остаточне значення аналізу для кожного зразка. Коефіцієнти варіації для аналізів на стероїдні гормони та ТТГ становили від 7,24 до 9,84%.
Фарбування гематоксиліном та еозином (ВІН) та імуногістохімія (IHC)
Щойно зібрані щитовидної залози та матки фіксували у 4% параформальдегіді протягом 24 годин на шейкері, а потім вносили у парафіновий віск. З кожної тканини, вкладеної у парафін, послідовно розрізали коронкові зрізи (товщиною 3 мкм). Зразки щитовидної залози, забруднені гематоксиліном та еозином (ВІН), визначали кількісно для зони інфільтрації мононуклеарних клітин щитовидної залози відповідно до попереднього дослідження [30]: 0 = відсутність інфільтрації; 1 = один або два фолікулярних інтерстиції, накопичені запальними клітинами; 2 = одне або два запальних клітинні ураження, що досягають фолікулярних розмірів; 3 = 10–40% запальна інфільтрація клітин; 4 = більше 40% запальної інфільтрації клітин. Крім того, фарбування ВІН ендометрію аналізували для морфологічного спостереження за допомогою мікроскопа Olympus DP80 (Olympus, Токіо, Японія). У кожній матці випадковим чином було обрано принаймні 3 несуміжні ділянки для обчислення кількості залоз (збільшення 40 ×).
Імуногістохімію (ІГХ) проводили за допомогою набору для виявлення SPlink. Зрізи матки товщиною п’ять мікрометрів були встановлені на предметних стеклах, депарафіновані та регідратовані через ксилол та сортовий спиртовий ряд. Після кожного кроку зрізи промивали 3 рази PBS (по 3 хв). Після гасіння активності ендогенної пероксидази 3% -ним перекисом водню протягом 10 хв, пошук антигену проводили шляхом пропарювання зрізів 0,01 М цитратним буфером (pH 6,0) протягом 20 хв. Неспецифічні сайти зв'язування блокували 5% нормальною козячою сироваткою протягом 30 хв до появи специфічних первинних антитіл проти ERα (ab96867, 1: 250) та PR (bs23376R, 1: 500), протягом ночі при 4 ° C. Слайди інкубували протягом 30 хв з біотинільованим козячим анти-кролячим IgG з подальшою інкубацією 45 хв з міченим пероксидазою хрону комплексом авідин-біотину. Імунофарбування було розроблено із застосуванням діамінобензидину. Предметні стійки були забарвлені гематоксиліном, зневоднені та змонтовані за допомогою монтажного середовища.