Трансляційна сигналізація, атрогенна та міогенна експресія генів під час розвантаження та перевантаження
Хізер К. Сміт
1 Департамент спорту та фізичних вправ Оклендського університету, Окленд, Нова Зеландія,
Кеннет Г. Метьюз
2 AgResearch Ltd., Сільськогосподарський центр Руакура, Гамільтон, Нова Зеландія,
Дженні М. Олдхем
2 AgResearch Ltd., Сільськогосподарський центр Руакура, Гамільтон, Нова Зеландія,
Ференц Жанплонг
2 AgResearch Ltd., Сільськогосподарський центр Руакура, Гамільтон, Нова Зеландія,
Шеллі Дж. Фальконер
2 AgResearch Ltd., Сільськогосподарський центр Руакура, Гамільтон, Нова Зеландія,
Джеймс Дж. Басс
3 Інститут Ліггінса, Оклендський університет, Окленд, Нова Зеландія,
Моніка Сенна-Салерно
2 AgResearch Ltd., Сільськогосподарський центр Руакура, Гамільтон, Нова Зеландія,
Джеремі В.
2 AgResearch Ltd., Сільськогосподарський центр Руакура, Гамільтон, Нова Зеландія,
Крістофер Д. Макмехон
2 AgResearch Ltd., Сільськогосподарський центр Руакура, Гамільтон, Нова Зеландія,
Задумав та спроектував експерименти: CDM HKS KGM JMO FJ JJB. Виконував експерименти: KGM CDM JMO SJF MSS JWB. Проаналізовано дані: CDM HKS JMO SJF JWB. Написав папір: CDM HKS FJ KGM.
Анотація
Вестерн-блот-аналіз
Зразок 150 мг бічного шлунково-м’язового м’яза гомогенізували в 1 мл буфера для лізису (10 мМ Hepes, 10 мМ KCl, 1,5 мМ MgCl, рН 7,9) з 0,5% миючим засобом IGEPAL (Sigma, MO, США) та інгібітором ферменту (Complete, Рош Діагностика). Зразки гомогенізували на льоду, потім центрифугували при 11000 × g протягом 10 хв. Супернатант відновлювали, змішували з завантажувальним буфером Леммлі [55], кип’ятили протягом 5 хв, потім зберігали при –20 ° C до аналізу. Концентрацію білка супернатанту визначали за допомогою аналізу на біцинхонінову кислоту (Sigma-Aldrich NZ, Auckland, NZ).
м 7 GTP-сефарозна хроматографія
Щоб перевірити, що стан фосфорилювання 4E-BP1 відображає зв'язування з eIF4E, ми використовували m 7 GTP-сефарозну 4B смолу для виділення та оцінки зв'язаного стану цих білків для завантаженого (день 0) та нерозвантаженого (день 2) порівняння, як раніше описані [56], [57]. Коротко, смолу m 7 GTP-сефарози 4В (GE Healthcare Ltd, Окленд, Нова Зеландія) двічі промивали буфером для лізису (описано вище) і 80 мкл 50% -ної суспензії змішували з 300 мкг супернатанту з гомогенізованого м’яза шлунково-кишкового тракту та дозволяється інкубувати протягом ночі при 4 ° С. Після центрифугування при 13000 × g та трьох промивань в 1 мл буфера для лізису, зв’язаний матеріал повторно суспендували у рівному обсязі 2x завантажувального буфера Леммлі. Вестерн-блот проводили шляхом завантаження 30 мкл зразка на 10% (eIF4E) або 15% (4E-BP1) гелі SDS-PAGE. Мембрани були заблоковані, як було описано раніше, і 4E-BP1 було виявлено шляхом інкубації з кролячими анти-4E-BP1 антитілами (1∶2000, Cell Signaling Technology Inc), тоді як eIF4E було виявлено інкубацією з моноклональним антитілом eIF4E миші (1∶2000, # sc9976, Санта Круз Біотехнологія Inc) за ніч. Виявлення було таким, як було описано раніше.
Оцінка ізоформ важкої ланцюга міозину
Розмір м’язового волокна
Статистичний аналіз
Волога маса м’язів виражалася відносно початкової маси тіла на d0. Дані піддавали дисперсійному аналізу з використанням GenStat версії 13 (VSN International Ltd) з урахуванням факторів генотипу (Mstn (-/-) або дикого типу), дня та їх взаємодії, включених у виклад моделі. Послідовне багаторазове порівняння проводили з використанням методу Тукі [61]. Дані представлені як середнє значення та стандартна похибка середнього значення (sem).
Результати
Миші обох генотипів втрачали масу тіла під час ГС і відновлювали масу тіла приблизно однаково під час перезавантаження (P Рисунок 1). Усі м’язи, зібрані від мишей Mstn (-/-), втрачали м’язову масу під час ГС, тоді як лише підошви мишей дикого типу втрачали масу під час ГС. Втрачена маса м’язів мишей Mstn (-/-) в основному була відновлена після 7 днів перезавантаження. Проте маса м'язів B. femoris та Quad Mstn (-/-) не була повністю відновлена d7 перезавантаження (рис. 2). Відносні втрати (∼20%, P Рисунок 2).