Тривале спостереження за індукованою бусереліном кишковою нейропатією у щурів

АНЕТТ ЙОНССОН

1 Відділ клінічних наук, Відділ внутрішньої медицини, Університетська лікарня Сконе, Університет Лунда, 205 02 Мальме, Швеція

ЕЛІН СЕНД

2 Відділ експериментальної медичної науки, відділення нейрогастроентерології, BMC B11, Університет Лунда, 221 84 Лунд, Швеція

EVA EKBLAD

БОДІЛ ОЛЬССОН

Анотація

У кількох пацієнтів було показано, що під час лікування аналогами гонадотропін-рилізинг-гормону (GnRH) розвиваються сильні болі в животі та порушується рухливість шлунково-кишкового тракту. Модель ентеральної нейропатії щурів була розроблена шляхом введення щурам аналога GnRH. Описано втрату кишкових нейронів та гангліоневрит у шлунково-кишковому тракті без інших гістопатологічних змін. Метою цього дослідження було дослідити довгостроковий вплив цієї моделі щурів на масу тіла, а також на морфологію та запальні зміни в шлунково-кишковому тракті. Щурам вводили підшкірні ін'єкції бусереліну або фізіологічного розчину один раз на день протягом 5 днів і дозволяли відновлюватися протягом 3 тижнів. Цей режим повторювали чотири рази. Щурів зважували щотижня і забивали через 16 тижнів після четвертої обробки. Морфометрією вимірювали стінку кишечника та оцінювали наявність кишкових нейронів, тучних клітин, еозинофілів та Т-лімфоцитів. Було показано, що щури, оброблені бусереліном, мали меншу масу тіла при жертві порівняно з контролем (Р Ключові слова: кишкова нейропатія, гонадотропін-рилізинг-гормон, шлунково-кишковий тракт, модель щурів

Вступ

Гормон, що вивільняє гонадотропін (GnRH), стимулює секрецію фолікулостимулюючого гормону (FSH) та лютеїнізуючого гормону (LH) з гіпофіза, які регулюють секрецію стероїдних гормонів, таких як естроген та прогестерон (1). Рецептори GnRH та LH ідентифіковані в шлунково-кишковому тракті людини та щурів (ШКТ) (2–4), де GnRH інгібує проліферацію клітин (5,6). Стимуляція ЛГ фрагментує мігруючий міоелектричний комплекс у тонкій кишці (7) та зменшує виживання ентерогенних нейронів щурів у культурі (8). Ряд пацієнтів страждають від побічних ефектів з боку шлунково-кишкового тракту під час лікування аналогами GnRH, а у деяких пацієнтів розвивається хронічна псевдообструкція кишечника (CIPO) або кишкова дизмотичність (ЕД) з дегенеративно-запальними змінами в шлунково-кишковому тракті (3,9).

Попередні дослідження на щурах показали, що аналоги GnRH спричиняють втрату підслизових та міентеріальних нейронів на очному дні, клубовій кишці та товстій кишці, без будь-якого впливу на масу тіла, циркулюючі запальні біомаркери або морфометрію стінки кишечника (4,10). Показано, що кількість тучних клітин та еозинофілів не змінюється; однак виявлено ознаки гангліоневриту з інфільтрацією Т-лімфоцитів у кишкових гангліях (4,11). Спостерігали підвищений рівень естрадіолу в плазмі та потовщений м’язовий шар матки, поряд із зменшенням відносної кількості нейронів, імунореактивних на рецептори ЛГ, та підвищеною імунореактивністю активованої каспази-3 (4,10). Таким чином, лікування бусереліном у щурів являє собою модель ентеральної нейропатії щурів, і передбачається, що втрата нейронів буде опосередкована за рахунок підвищеного вивільнення ЛГ та гіперактивації кишкових нейронів, що несуть рецептори ЛГ (4,10,11), що призводить до посилення апоптозу (4, 12).

Попередні результати базуються на дослідженнях, при яких тварин приносили в жертву незабаром після остаточної обробки бусереліном (4,10,11). Метою цього дослідження було дослідити довгостроковий вплив бусерелінової кишкової нейропатії на масу тіла та шлунково-кишковий тракт щодо втрати нейрональних клітин, морфології та запальних змін.

Матеріали і методи

Тварини

Використовували самок щурів Sprague-Dawley (n = 20; вік, 7 тижнів; вага, 170–180 г), придбаних у лабораторіях Charles River (Сульцфельд, Німеччина). Щурам дозволяли пристосуватися до кліматичного та контрольованого світлом приміщення для тварин протягом принаймні 5 днів перед експериментами. Стандартна щуряча чау (4% жиру/г) (Lactamin R36, Стокгольм, Швеція) та вода постачалися за бажанням. Експериментальний проект був схвалений Комітетом з етики тварин, Лунд та Мальме, Швеція (M350–12, дата затвердження: 14.11.12). Тварин використовували відповідно до Директиви Ради Європейських Співтовариств (2010/63/ЄС) та Шведського закону про добробут тварин (SFS 1988: 534).

Вивчати дизайн

Щурам (n = 12) вводили 20 мкг аналога GnRH-бусереліну (1 мг/мл) (Suprefact, Sanofi-Aventis, Bromma, Швеція) (розчиненого в 0,2 мл фізіологічного розчину) підшкірно, один раз на день протягом 5 днів, а потім 3 тижнів одужання, що представляє один сеанс лікування (4). Дозування та введення бусереліну базуються на попередніх дослідженнях, які показали надійні фізіологічні ефекти з точки зору гіпертрофії матки без будь-яких негативних наслідків (4,10,13). Контрольні тварини (n = 8) отримували 0,2 мл фізіологічного розчину. Тварин зважували перед включенням у дослідження та щотижня вранці під час дослідження. Через тридцять два тижні після початку дослідження та через 4 місяці після останнього сеансу лікування щурів знеболювали за допомогою хлоралгідрату (300 мг/кг маси тіла; C8383; Sigma-Aldrich, Сент-Луїс, Міссурі, США) і вбивали пункцією аорти. Зразки тканин із очного дна, дистального відділу клубової кишки, проксимального відділу ободової кишки та дистальної частини рогу матки були зібрані та оброблені для гістологічної оцінки.

Підготовка тканин

Очне дно/тіло шлунка, клубова кишка (починаючи 8 см проксимальніше сліпої кишки і продовжуючи в проксимальному напрямку) і товста кишка (починаючи 2 см дистально від сліпої кишки і продовжуючи в дистальному напрямку) відкрили і сплющили на фільтрувальному папері . По одній ділянці кожної області кишки фіксували в закріплювачі Стефаніні (суміш 2% формальдегіду (Sigma-Aldrich) і 0,2% пікринової кислоти (Sigma-Aldrich) у фосфатному буфері, рН 7,2) протягом 22 год при 4 ° C, і інші ділянки та роги матки фіксували у 4% параформальдегіді (Sigma-Aldrich) у 0,1 М фосфатному буфері протягом 22 год при 4 ° C. Зразки, закріплені за Стефаніні, тричі промивали в розчині Тирода, що містить 10% сахарози, перед тим, як їх орієнтувати і встановити для поперечного та поздовжнього зрізу в тканині Тек (Сакура, Гістолаб, Гетеборг, Швеція), заморозити на сухому льоду та розрізати (10 мкм) в кріостаті (HM500; Microm GmbH, Вальдорф, Німеччина). Зразки, зафіксовані параформальдегідом, зневоднювали в етанолі, очищали в ксилолі, орієнтували для поперечного та поздовжнього зрізу, вкладали в парафін і розрізали (5 мкм). Зрізи обробляли для імуноцитохімії та гістохімії.