Тунельне перенесення нанотрубок (TNT) з нейрону в нейрон перенесення патологічних збірок білка Тау

Анотація

Дана клітина здійснює обмін зі своїми сусідами різними способами, починаючи від дифузійних факторів і закінчуючи везикулами. Клітини використовують також тунелюючі нанотрубки (ТНТ), ниткоподібно-актиносодержащіе мембранні структури, які з’єднують та з’єднують клітини. Вперше описані в імунних клітинах, TNT сприяють передачі ВІЛ-1 і знаходяться в різних типах клітин, включаючи нейрони. Ми показуємо, що асоційований з мікротрубочками білок Tau, ключовий фактор хвороби Альцгеймера, є добросовісною складовою частиною тротилу. Це важливо, оскільки Тау з'являється поруч з ниткоподібним актином та міозином 10 як специфічний маркер цих дрібних виступів мембран та цитозолю, які важко візуалізувати. Крім того, ми спостерігали, що екзогенні види Tau збільшують кількість TNT, встановлених між первинними нейронами, полегшуючи тим самим міжклітинний перенос фібрил Tau. На закінчення, Tau може сприяти формуванню та функціонуванню високодинамічних тротилів, які можуть брати участь у пріоноподібному розповсюдженні агрегатів Tau.

нейрон

Вступ

Розуміння передачі інфекційного агента від однієї клітини до іншої було проблемою минулого століття. Показано залучення рецепторів клітинної поверхні, але також описані інші шляхи. Тунельні нанотрубки (ТНТ) утворюють один із таких шляхів. ТНТ були описані в різних типах клітин, включаючи нейронні та імунні клітини. Вони являють собою мембранні структури, що містять ниткоподібні актини, діаметром від 50 до 800 нм, не завжди пов’язані з субстратом, і утворюють містки, що з’єднують віддалені клітини [1–6]. Наприклад, TNT фізично з'єднують Т-клітини, представляючи новий шлях передачі ВІЛ-1 [7]. У таких клітинах кінчик тротилу є активною зоною реорганізації цитоскелету актину і містить езрін, Exo70, міозин 10 та N-WASP, що передбачає регуляцію на клітинному рівні [8, 9]. Зовнішні фактори, такі як арахідонова кислота в ендотеліальних клітинах [10], інфекція ВІЛ-1 у макрофагах [11], окислювальний стрес [12] та пріоноподібні білки (наприклад, фібрили Хантінгтіна, TDP-43) у нейрональних клітинах [6, 13, 14] було показано, що ініціює утворення тротилу.

Багато білкових агрегатів мають пріоноподібні властивості: вони можуть виступати як саморозмножуються шаблони. Вони порушують клітинний протеостаз, що в кінцевому підсумку призводить до нейродегенеративних розладів, таких як хвороба Альцгеймера (AD), хвороба Паркінсона (PD), аміотрофічний бічний склероз (ALS) або трансмісивні губчасті енцефалопатії (TSE) [15–17]. Точні механізми поширення патологічних видів від клітини до клітини все ще підлягають інтенсивному дослідженню. Серед інших роль тротилу в такому розповсюдженні пропонується при хворобі Хантінгтона, хворобі Паркінсона та ALS/лобно-скроневій деменції [18]. Що стосується хвороби Альцгеймера, амілоїдний Aβ-пептид продемонстрував рух через TNT і викликав цитотоксичність [12]. Роль тротилу в сукупному розповсюдженні Тау ще не задокументована.

У цій роботі, використовуючи дві різні клітинні моделі (клітини CAD нейронів і первинні ембріональні кортикальні нейрони щурів), ми демонструємо, що позаклітинний вид Tau діє як зовнішній фактор, що призводить до посиленого утворення TNT, що в свою чергу сприяє міжклітинному поширенню патологічного Tau.

Матеріали і методи

Заява про етику- Тварин забезпечували лабораторії Янв’є і вони мали доступ до їжі та води за бажанням. Експерименти на тваринах проводились відповідно до та з затвердженням місцевого комітету з етики (угода CEEA 062010R), стандартів догляду та використання лабораторних тварин, а також керівних принципів Франції та Європейського Співтовариства.

Культура клітин

Первинна ембріональна нейрональна культура- Первинні ембріональні кортикальні нейрони щурів (первинні нейрони) готували із 17–18-денних ембріонів щурів Wistar наступним чином. Мозок та мозкові оболонки були вилучені. Кору розсікали і механічно дисоціювали в живильному середовищі розтиранням за допомогою полірованої піпетки Пастера. Після дисоціації та після підрахунку блакитного трипану клітини висівали в Ibidi μ-посуд (Biovalley) або предметні стекла з чотирма лунками Lab-Tek (Becton Dickinson), покриті полі-D-лізином (0,5 мг/мл) та ламініном (10 мкг/мл). Для дисоціації, покриття та обслуговування ми використовували нейробазальне середовище, доповнене 2% B27, що містить 200 мМ глутаміну та 1% антибіотико-антимікотичного агента (Invitrogen). Первинні нейрони через 7 днів in vitro (DIV7) були заражені лентівірусними векторами (LV), що кодують GFP/mCherry актин, тубулін або дикий тип людини Tau (hTau1N4R, що містить мітку V5; V5-hTau1N4R).

Клітинні лінії- Клітини САП мишачих нейронів (катехоламінергічна клітинна нейрональна клітинна лінія, диференційована Cath.a) культивували в Opti-MEM (Invitrogen) з 10% фетальної бичачої сироватки, пеніциліну/стрептоміцину (1%) і L-глутаміну (1%). Нейронні клітини САПР висаджували на ніч у покриті полі-D-лізином (0,5 мг/мл) покриті Ibidi μ-посуд для живої візуалізації або слайди з чотирма лунками Lab-Tek для імунозабарвлення. Нейронні клітини САПР інфікували LV, що кодують GFP-актин, mCherry-тубулін або людський дикий тип Tau (hTau1N4R, що містить мітку V5; V5-hTau1N4R).