Умовна делеція феритину Н у мишей спричиняє втрату запасу заліза та пошкодження печінки - Даршан

Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL), ISREC - Швейцарський інститут експериментальних досліджень раку, Лозанна, Швейцарія

Ці автори не менш сприяли цій роботі.

Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL), ISREC - Швейцарський інститут експериментальних досліджень раку, Трансгенна мишача установа, Лозанна, Швейцарія

Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL) ISREC - Швейцарський інститут експериментальних досліджень раку, SV2516 - Bâtiment SV, станція 19, CH ‐ 1015 Лозанна, Швейцарія === Шукати інші статті цього автора

Ці автори не менш сприяли цій роботі.

Потенційний конфлікт інтересів: нічого не повідомляти.

Анотація

Білкові оболонки 24 феритинових субодиниць H та L можуть накопичувати до 4500 атомів заліза у вигляді Fe 3+ у всіх тканинах, але найбільш помітно в гепатоцитах та ретикулоендотеліальних клітинах печінки та селезінки. 1 Субодиниця ферритину Н має ферроксидазну активність, необхідну для осадження заліза. 2, 3 Трансляція обох субодиниць регулюється регулюючими залізом білками 1 та 2 (IRP1 та IRP2) у відповідь на наявність заліза. Таким чином, кількість феритину адаптується до рівня заліза в організмі. Залізо, що зберігається у феритині, може бути мобілізовано до його деградації. 5 Вважається, що функція знешкодження заліза феритину також запобігає опосередкованому залізом каталізу активних форм кисню (АФК), які провокують пошкодження тканин 6 і можуть спричинити рак 7 та нейродегенерацію. 8

Тут ми генерували мишей, що несуть сайти loxP 5 ' Fth генний промотор та 3 ′ екзону 1 для того, щоб видалити експресію ферритину Н у дорослих мишей за допомогою Cre рекомбінази. Ми умовно видалили файл Fth ген у дорослих самців мишей, що використовують Cre під контролем полі-IC-індуцибельного промотору гена Mx. 23 Це майже повністю видаляє феритин Н із печінки, кісткового мозку, селезінки та тимусу, але менш помітно в інших тканинах. Тут ми повідомляємо про вплив на зберігання заліза, токсичність заліза, гематологічні параметри та життєздатність клітин. Ми досліджували наслідки перевантаження залізом до або після делеції феритину Н і виявили швидку загибель клітин у печінці та у ембріональних фібробластів мишей, отриманих від наших мишей. У культивованих клітинах причину смерті можна віднести до АФК, деполяризації мітохондрій та переходу проникності.

Скорочення

АЛТ, аланінамінотрансфераза; AST, аспартатамінотрансфераза; Fth ген, ген феритину H; IRP, білок, що регулює залізо; АФК, активні форми кисню; ТУНЕЛЬ, маркування трансферази dUTP на нижньому кінці.

Матеріали і методи

Всі експериментальні процедури доступні як допоміжні матеріали та методи.

Результати

Умовна делеція феритину Н смертельна для ембріонів.

Для вивчення функції феритину Н у дорослих мишей ми генерували шляхом рекомбінації ембріональних стовбурових клітин мишей із модифікованим алелем ферритину Н, що позначаються як Fth loxNeo . У цьому алелі промотор феритину H та екзон 1 межують з сайтами loxP, які також фланкують касету відбору неоміцину між сайтами FRT (підтримка рис. 1). Щоб перевірити нашу стратегію націлювання на феритин H, ми перейшли Fth loxNeo миші з гемізиготними мишами нестин-Cre1. 24 Промотор нестину демонструє складну схему експресії з активністю в мозку, а також в зародковій лінії. 24 Отже, очікувалося, що повне видалення феритину Н відбудеться в Fth loxNeo/ +;Nes-Cre1 тварини. З 38 мишей F2 17 (44,7%) були Fth +/ + і 21 (55,3%) були Fth +/ -, що підтверджує нестин-Cre-індуковану делецію. Ні Fth -/- народилися миші, що вказує на важливу функцію феритину Н в ембріогенезі. Ці результати найкраще пояснюються делецією зародкової лінії феритину Н у Fth loxNeo/ +;Nes-Cre1 F1 покоління 24 з ембріональною летальністю при Fth ген відсутній у статевих клітинах. 9 Це узгоджується з раніше опублікованими дослідженнями щодо ембріональної летальності делеції феритину у мишей.

Делеція феритину Н у дорослих тварин викликає втрату запасів заліза.

Умовна делеція феритину Н за допомогою Mx-Cre зменшує накопичення заліза в печінці та селезінці. Десяти тижнів Fth локс/локс;Mx-Cre та контролю Fth локс/локс мишам вводили полі-IC для активації експресії Cre. (А) На 10-й день делецію феритину Н оцінювали в різних тканинах методом ПЛР у реальному часі на геномній ДНК (зелений) та комплементарній ДНК феритину Н (кДНК) (синій). Вміст тканинного заліза (червоний) вимірювали методом батофенантроліну. Значення в Fth Миші Δ/Δ (n = 4) виражаються у відсотках від значень у Fth локс/локс мишей (n = 4) встановлено як 100% ± стандартне відхилення (SD). (B) Імунофлуоресцентне фарбування феритину H та L у заморожених зрізах печінки (день 10). Шкала шкали = 200 мкм. (C) Імуноблот-аналіз феритину H печінки в одному Fth локс/локс миша і два Fth Миші Δ/Δ на 3 і 10 день. (D) Заморожені зрізи селезінки, пофарбовані прусським синім кольором Перла на 30 день. Шкала шкали = 200 мкм. (E) Заморожені зрізи селезінки, забарвлені для макрофагів антитілами до CD11b та анти-F4/80, а також 4 ', 6-діамідино-2-феніліндол (DAPI). Шкала шкали = 100 мкм.