Вірус собачої пухирці - захворювання, що виникає у диких зникаючих амурських тигрів (Panthera tigris altaica

АНОТАЦІЯ

ЗНАЧЕННЯ Визнання появи хвороб у дикій природі - рідкісне явище. Тут ми вперше виявляємо та характеризуємо вірус собачої чуми (CDV), другу за частотою причину смерті від інфекційних хвороб домашніх собак та вірусне захворювання, що має глобальне значення у звичайних та зникаючих хижих тварин, як етіологію неврологічного захворювання та летальний енцефаліт у диких амурських тигрів, що перебувають під загрозою зникнення. Ми встановлюємо, що в 2010 році CDV прямо чи опосередковано вбито

1% амурських тигрів. Розташування позитивних випадків на великій географічній території свідчить про те, що CDV широко розповсюджений по всьому ареалу тигра. Міжвидові взаємодії посилюються в міру зростання та розширення популяцій людей у місцях проживання дикої природи. Визначення резервуарів тварин для CDV та виявлення штамів CDV, які передаються до видів дикої природи та серед них, включаючи амурських тигрів та симпатичних амурських леопардів (Panthera pardus orientalis), має важливе значення для керівництва зусиллями щодо збереження та пом'якшення наслідків.

Спостереження

Тканини, зібрані під час процедур розтину, у п’яти дорослих вільних тигрів, які загинули природним шляхом або були знищені в РЧЕ в 2001, 2004 або 2010 роках, були доступні для гістопатології, фарбування ІГХ, гібридизації in situ (ISH) та зворотної транскрипції-ПЛР ( RT-PCR) тестування. Мозкова тканина, критична для оцінки CDV-інфекції, була доступна у двох тигрів (Pt2004 та Pt2010-3); легені, основне місце реплікації CDV, було доступне у всіх тигрів.

Гістологічну обробку фіксованих формаліном тканин проводили за допомогою звичайних методів. П’ять-вісімнадцять з двадцяти двох різних типів тканин (жирова тканина, наднирники, артерія, мозок, серце, нирки, товста кишка, печінка, легені, лімфатичний вузол, яєчник, підшлункова залоза, периферичний нерв, слюнна залоза, скелетні м’язи, селезінка, шлунку, тонкої кишки, яєчка, язика, трахеї або сечового міхура) були доступні від кожної тварини для гістологічного огляду. Мікроскопію яскравого поля проводили за допомогою мікроскопа Leica DM2500 (Leica Microsystems Wetzlar GmbH, Wetzlar, Німеччина).

IHC для антигену вірусу чуми собак проводили із застосуванням первинного моноклонального антитіла до поверхневої оболонки анти-CDV, як описано раніше, та включали позитивний та негативний контроль (5). Мікроскопію яскравого поля проводили, як описано вище.

Для ISH зонди до нуклеотидної області 600 п.н. гена фосфопротеїну (P) вірусу чуми собак були розроблені Panomics (Affymetrix, Inc., Санта-Клара, Каліфорнія). Ця область відповідає нуклеотидам з 1926 по 2526 генома CDV (номер приєднання GenBank AF378705). ISH із використанням фарбування Fast Red проводили з використанням набору РНК Panomics QuantiGene View для закріплених формаліном ділянок, вбудованих у парафін, згідно з протоколом виробника (продукт QV0050, QuantiGene ViewRNA FFPE; Affymetrix, Inc., Санта-Клара, Каліфорнія) та, як описано раніше (7). Зрізи фарбували гематоксиліном. Повторювані секції виконувались без зонда як негативний контроль. Мікроскопію яскравого поля проводили, як описано вище.

Для визначення філогенетичних зв'язків тигрових CDV між собою та з іншими вірусами CDV та морбілівірусами вирівнювали послідовності нуклеотидів для генів P і H від тигрів та репрезентативних штамів CDV (GenBank, Національний центр біотехнологічної інформації; http: // www .ncbi.nlm.nih.gov) (програмне забезпечення Geneious Pro 5.1.7; Biomatters Ltd., Окленд, Нова Зеландія). Парні ідентичності були отримані за допомогою аналізу PAUP для створення запущеної матриці попарного порівняння P-відстані (плагін PAUP у Geneious Pro). Байєсівський аналіз проводили за допомогою плагіна MrBayes 3.1 у Geneious Pro, використовуючи гамма-розподілену варіацію швидкості та модель заміщення HKY85 (8). Перші 25% з 1 100 000 довжини ланцюга були відкинуті як прогорання, а 4 ланцюги з підігрівом працювали з частотою субдискретизації 200. Вірус чуми чуми (номер приєднання AF132934) використовувався як позагрупова група. Дерева були доопрацьовані та марковані (програмне забезпечення FigTree v1.3.1 [Ендрю Рамба, Інститут еволюційної біології, Единбурзький університет, 2006–2009; http://tree.bio.ed.ac.uk/]). Розраховувались значення задньої вірогідності.

У період з січня по червень 2010 року троє дорослих вільних амурських тигрів (Panthera tigris altaica) (Pt2010-1, Pt2010-2 і Pt2010-3) потрапили в села на території Радянського Свободи (рис. 1А і В). Кожен був убитий (Pt2010-1 та Pt2010-3) або помер природним шляхом (Pt-2010-2) після виявлення ненормальної неврологічної поведінки (дезорієнтація, відсутність реакції на стимуляцію та/або неагресивна безстрашність). До 2010 року ще два вільних амурських тигра (Pt2001 та Pt2004) були захоплені та загинули після виявлення подібної неврологічної поведінки (рис. 1A та B). Чотири з п'яти тигрів були виснаженими або демонстрували надзвичайну втрату ваги на момент смерті (рис. 1Б).

Географічний розподіл (A) та історична інформація (B) для тигрів на російському Далекому Сході, які загинули або були вбиті внаслідок аномальної неврологічної поведінки в 2001, 2004 або 2010 рр. (C) Tiger Pt2010-3: hematoxylin-and-eosin- пофарбований зріз мозку з нейрональними внутрішньоядерними еозинофільними вірусними включеннями (стрілка). (D) Tiger Pt2010-3: позитивне імуногістохімічне фарбування нейронів первинним антитілом моноклонального IgG до антигену білка оболонки вірусу CDV (стрілки) (швидке червоне фарбування). (E та F) Позитивна гібридизація in situ (швидкий червоний) зондів до послідовності гена CDV P у заражених CDV нейронах у тигра Pt2004 (E) та тигра Pt2010-3 (F). Штрих = 50 мкм на всіх зображеннях.