Вивільнення нейромедіатора, регульоване пресинаптичним комплексом MALS – ліпрін-α

Олав Олсен

1 Кафедра фізіології Каліфорнійського університету, Сан-Франциско, Сан-Франциско, Каліфорнія 94143

Кімберлі А. Мур

2 Кафедра клітинної та молекулярної фармакології Каліфорнійського університету, Сан-Франциско, Сан-Франциско, Каліфорнія 94143

Масакі Фуката

1 Кафедра фізіології Каліфорнійського університету, Сан-Франциско, Сан-Франциско, Каліфорнія 94143

Тошинарі Казута

1 Кафедра фізіології Каліфорнійського університету, Сан-Франциско, Сан-Франциско, Каліфорнія 94143

Джонатан С. Тринідад

3 Кафедра фармацевтичної хімії Каліфорнійського університету, Сан-Франциско, Сан-Франциско, Каліфорнія 94143

Фред В. Кауер

1 Кафедра фізіології Каліфорнійського університету, Сан-Франциско, Сан-Франциско, Каліфорнія 94143

Мішель Стреулі

4 ImmunoGen, Inc., Кембридж, Массачусетс 02139

Хідемі Місава

5 Департамент неврології, Столичний інститут неврології, Токіо 183-8526, Японія

Альма Л. Берлінгейм

3 Кафедра фармацевтичної хімії Каліфорнійського університету, Сан-Франциско, Сан-Франциско, Каліфорнія 94143

Роджер А. Ніколл

1 Кафедра фізіології Каліфорнійського університету, Сан-Франциско, Сан-Франциско, Каліфорнія 94143

Девід С. Бредт

1 Кафедра фізіології Каліфорнійського університету, Сан-Франциско, Сан-Франциско, Каліфорнія 94143

Анотація

Синапси - це вузькоспеціалізовані міжклітинні з’єднання, організовані молекулами адгезиву та лісів, які вирівнюють пресинаптичний везикулярний вивільнення з постсинаптичними рецепторами нейромедіаторів. Комплекс білків PDZ MALS/Veli – CASK – Mint-1 зустрічається по обидва боки синапсу і має потенціал пов’язувати молекули транссинаптичної адгезії з цитоскелетом. У цьому дослідженні ми очистили білковий комплекс MALS від мозку та виявили ліпрін-α як головний компонент. Білки ліприну організовують пресинаптичну активну зону і регулюють вивільнення нейромедіаторів. Зазвичай, мутантні миші, яким бракувало всіх трьох ізоформ MALS, помирали перинатально з утрудненим диханням та порушенням збудливо-синаптичної передачі. Збудливі постсинаптичні течії різко зменшились у аутаптичних культурах у мишей з потрійним нокаутом MALS через дефіцит пресинаптики в циклічному циклі. Ці висновки узгоджуються з моделлю, згідно з якою комплекс MALS – CASK – liprin-α завербує компоненти апарату синаптичного вивільнення до адгезивних білків активної зони.

Вступ

Синаптична передача вимагає точного узгодження пре- та постсинаптичної спеціалізацій. З пресинаптичної сторони синаптичні везикули, що містять нейромедіатори, повинні бути вирівняні та стиковані в активних зонах, де везикули зливаються з пресинаптичною мембраною для секреції (Südhof, 2004). На постсинаптичній стороні нейромедіаторні рецептори повинні бути згруповані разом з відповідними механізмами передачі сигналу, щоб реагувати на випущені передавачі. Нещодавні дослідження почали з'ясовувати молекулярний механізм, відповідальний за організацію синаптичних з'єднань. Молекули адгезії, що охоплюють синаптичну щілину, діють як на стабілізацію, так і на визначення пресинаптичної активної зони та постсинаптичну спеціалізацію (Ichtchenko et al., 1995; Fannon and Colman, 1996; Flanagan and Vanderhaeghen, 1998). Цитозольні молекули, пов’язані з цими адгезивними факторами, допомагають розташувати синаптичні везикули та нейромедіаторні рецептори на відповідних сторонах синапсу (Hata et al., 1996; Torres et al., 1998; Perego et al., 2000).

Один з таких наборів модульних білків риштування складається з потрійного комплексу MALS/Veli (ссавців LIN-7/гомолог хребетних LIN-7), CASK (білок периферичної плазматичної мембрани) та Mint-1 (білок 1, що взаємодіє з munc-18), які є хребетними гомологами комплексу, вперше виявленого у Caenorhabditis elegans, який опосередковує розвиток вульви (Kaech et al., 1998). У мозку ссавців комплекс MALS – CASK – Mint-1 зустрічається по обидва боки синаптичних з’єднань і вважається, що він виконує різні ролі в цих двох місцях. Пресинаптично цей комплекс пов'язує з нейрексином (Hata et al., 1996), молекулою адгезії, яка зв'язується через синапс з постсинаптичним нейролігіном (Ichtchenko et al., 1995). Крім того, Mint-1 співпрацює з Munc18-1, важливим компонентом апарату злиття синаптичних пухирців (Okamoto and Südhof, 1997). Посинаптично MALS зв’язується з N-метил-d-аспартатом (NMDA) - типом глутаматних рецепторів (Jo et al., 1999), і повідомляється, що він транспортує везикули рецепторів NMDA вздовж мікротрубочок (Setou et al., 2000).

Генетичні дослідження не змогли встановити суттєву роль комплексу MALS – CASK – Mint-1 у мозку. Три гени MALS існують у ссавців (Borg et al., 1998; Butz et al., 1998; Jo et al., 1999), а цілеспрямоване порушення MALS-1 і MALS-2 призводить до компенсаторної регуляції MALS-3 в ЦНС (Misawa et al., 2001). Мутантні миші монетного двору-1 не виявляють дефектів збуджуючої синаптичної передачі, а лише незначний дефект гальмівної синаптичної передачі (Ho et al., 2003). Також не повідомляється про синаптичний аналіз щодо нокаутів CASK, які гинуть при народженні через дефекти середньої лінії (Laverty and Wilson, 1998).

Кілька молекул, які опосередковують розвиток синапсів, були виявлені за допомогою генетичних досліджень безхребетних. Наприклад, мутація C. elegans syd-2 розсіює пресинаптичні активні зони (Zhen and Jin, 1999). Подібний структурний дефект зустрічається у мух, у яких відсутній ортолог Drosophila melanogaster syd liprin-α, що супроводжує супутнє зниження синаптичної передачі (Kaufmann et al., 2002). Ліпрін-α зв'язується з рецепторним білком тирозинфосфатазою Длар (Serra-Pages et al., 1998), пропонуючи модель, за допомогою якої ліпрін-α і Длар співпрацюють для організації пресинаптичних активних зон. Залишається невизначеним, як ліпрін-α зв'язується з механізмом синаптичних пухирців.

Для визначення основних ролей комплексу MALS у ссавців ми очистили комплекс MALS від мозку. Виділення комплексу MALS виявило зв'язок із сімейством молекул цитоскелетної та пресинаптичної адгезії. Що важливо, ми виявили ліпрін-α1, -α2, -α3 та -α4 у комплексі MALS. Асоціація з цим комплексом опосередковується через SAM-домени в ліприн-α та NH2-кінцеву область у CASK. Використовуючи стерильні домени α мотиву (SAM) ліпріну-α як домінантного негативу, ми порушили комплекс MALS – ліпрін у дисоційованих нейронах. Щоб зрозуміти функцію комплексу MALS, ми створили мутантних мишей, у яких відсутні всі три гени MALS. Миші, у яких не було жодного гена, були життєздатними та фертильними. Однак миші, у яких відсутні всі три гени MALS, загинули протягом однієї години після народження. Ця перинатальна летальність пов'язана з порушенням пресинаптичної функції, що відображає пресинаптичний дефіцит безхребетних, яким не вистачає ортологів ліпрін-α. Ці дослідження встановлюють вирішальну роль комплексу MALS в екзоцитозі синаптичних пухирців та залученні ліприну-α до цього процесу.