Вплив харчового жиру на фенотип поліпів у мишей з множинною кишковою неоплазією PNAS

Ми представляємо тут ефекти збільшення жирових відкладень жиру на формування поліпів кишечника та виживання на цій миші із спонтанною кишковою пухлиною.

харчового

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ

Створення Імперського фонду досліджень раку (ICRF) MIN C57/BL 6J Colony.

MIN (C57BL/6JApc Min/+ Apc) миші-гетерозиготи спочатку були отримані в 1992 році (подарунок від A. Moser, McArdle Labs, University of Wisconsin, Madison). Спочатку самців мишей перетинали до самок C57BL/6J (ICRF Biological Resources, Clare Hall, South Mimms, Хартфордшир, Великобританія), а отримані ембріони передавали асептичною гістеректомією прийомним матерям у зазначених ізоляторах, вільних від патогенів. Потім все розведення проводили у зазначених одиницях, вільних від патогенів, братом (C57BL/6J-Apc Min/+ Apc) -сестрою (C57BL/6J).

Генотипування проводили за допомогою ПЛР-реакції, використовуючи три праймери, включаючи внутрішній контроль нормальної ДНК миші, як описано (15). ДНК витягували з вушних або хвостових фрагментів у віці 21 дня. Коротко, вушні відрізки поміщали в 20 мл свіжоприготованого буфера для лізису [12,5 мкл 1 М Трис (рН 8)/1 мкл 5 М NaCl/2,5 мкл 10% SDS/25 мкл 10 мг/мл протеїнази К/250 мкл автоклавного подвійного -дистильований H2O] і перемішують і нагрівають у ванні при 55 ° C протягом 1 години, знову перемішують і нагрівають додатково 2 години і переносять на лід. Додавали вісімдесят мікролітрів ddH2O і дайджест кип’ятили протягом 15 хв для інактивації протеїнази К. Потім 2,5 мкл цієї суміші використовували для 25-мкл ПЛР. В якості альтернативи 1 см фрагментованого хвоста миші (отриманого під наркозом) поміщали в буфер для лізису хвоста (700 мкл TEN/35 мкл 20% SDS/35 мкл 10 мг/мл протеїнази К) та інкубували протягом ночі при 56 ° C. ДНК отримували стандартною екстракцією фенол/хлороформ з осадженням ізопропанолом і зберігали в 250 мкл TE. Половину мікролітра цієї суміші використовували для 25-мкл ПЛР.

Двісті двадцять дев'ять (C57BL/6J-Apc Min/+ Apc) (MIN) і 23 (C57BL/6J- + Apc/+ Apc) (дикий тип) контрольні миші були випадковим чином стратифіковані проспективно (з понад 50 спарювань) на 3 дієтичні групи наступним чином:

(i) "Стандартна" дієта із загальним вмістом жиру приблизно 3% (дієта для гризунів ICRF GR3EK.R20, Special Dietary Services, Witham, Ессекс, Великобританія). Вміст сирої клітковини в цій дієті (за оцінкою методики кислотно-лужної екстракції) становить 4,1%, а вміст вуглеводів та сирого білка 58% та 19,8% відповідно.

(ii) "Жирна" дієта із загальним вмістом жиру не менше 10% [Дієта заводчика мишей Teklad (W) 8626; Медісон, штат Вісконсин], отримане з того самого джерела, що і в перших опублікованих даних на MIN (11). Компоненти, крім вмісту жиру в цій дієті, також варіювались від дієт (i) та (iii), оскільки вміст сирої клітковини зменшився вдвічі до 2%, хоча сирий білок подібний на 20%.

(iii) Дієта з високим вмістом жиру із загальним вмістом жиру приблизно 15%. Це було спеціально відновлено за допомогою SDS із 85 мас.% Стандартної дієти для гризунів GR3EK.R20 ICRF (тобто, як дієта i вище), з додатковою масою 15% кукурудзяної олії. Чотири основні складові жирних кислот у використаній кукурудзяній олії: 42,9% лінолевої, 23,4% олеїнової, 9,8% пальмітинової та 2% стеричної.

Отже, стандартні (i) та дієти з високим вмістом жиру (iii) подібні, крім загального вмісту жиру, тоді як дієта (ii) Жир відрізняється жиром і має нижчий склад клітковини. Діапазон дієт був частково підібраний, щоб допомогти врахувати істотно меншу кількість поліпів та збільшену виживаність, яку ми спочатку спостерігали у наших мишей ICRF MIN, порівняно з початково опублікованими даними, з яких отримували наших мишей MIN (11).

Дієти були випадковим чином розподілені та ініційовані за умови звільнення приблизно у 21-денному віці після їх переведення у спеціальні ізолятори, розміщені в окремому "відкритому" блоці (тобто в звичайних неспецифікованих лабораторних умовах тварин, що не містять патогенів). Не було зроблено спроб коригування калорійності дієтичних показників, оскільки споживання та використання кінцевої калорійності мишами неможливо легко контролювати чи оцінювати, а також додатково ускладнюється потенційними різницями смакових якостей між трьома дієтами. Також були повідомлення про ненормальне поводження з дієтою, включаючи стійкість до ожиріння у лабораторної миші C57BL, основа якої незрозуміла (16). Однак мишей зважували у своїх стратифікованих групах щотижня, від відлучення до жертви. Мишей C57BL/6J- + Apc/+ Apc кожної статі також випадковим чином розподіляли як негативний контроль у кожній дієтичній групі, щоб виключити можливі несподівані несприятливі дієтичні ефекти, а також як позитивний контроль для порівняння ваги. Це мало забезпечити, щоб наші спостереження не були збентежені згубними ефектами, незалежними від фенотипу MIN, або навпаки, ненормальним харчуванням, яке може залежати від MIN.

Потреба в жертвоприношенні визначалася незалежними техніками, які щодня оцінювали мишей. Смертність від МІН зазвичай обумовлена ​​важкою прогресуючою анемією, випаданням прямої кишки або кишковою непрохідністю. Прогресування пухлини молочної залози діаметром понад 1 см також вимагає жертви. Коли це було можливо, патологоанатомічні дослідження, підрахунок та вимірювання проводили одиноко сліпими лише одна людина (H.S.W.), інакше вимірювання пухлини не враховували. У посмертних відділах кишечник виділяли, розсікали поздовжньо, промивали тричі в PBS і розподіляли на 3ММ папір. Тонка кишка була розділена на три приблизно рівні відділи [проксимальний (SB1), середній (SB2) і дистальний (SB3)]. Потім була проведена оцінка видимого числа, розміру [середнє значення двох найбільших діаметрів із цифровими штангенциркулями (Micron Sales, Лондон)] та розподілу кишкових пухлин під розсічним мікроскопом × 10. Точність дозволу розміру пухлини при такому підході вимагала підрахунків на інтервалі 1 мм. Потім зрізи фіксували у 9% -ному сольовому розчині та вносили у парафін для гістологічної оцінки. Усі процедури затверджені Комітетом з етики тварин ICRF.