Вплив перорального введення синтетичного фрагмента гормону росту людини на ліпідний обмін

Кафедра біохімії та молекулярної біології Університету Монаш, Клейтон, Вікторія 3148; і

Медичний факультет, Королівська лікарня Мельбурна, Парквілл, Вікторія 3050, Австралія

Кафедра біохімії та молекулярної біології Університету Монаш, Клейтон, Вікторія 3148; і

Анотація

ожиріння є основною проблемою охорони здоров'я в більшості розвинених країн. Наприклад, в Австралії майже кожен п'ятий дорослий страждає ожирінням, що робить їх дуже сприйнятливими до діабету, ішемічної хвороби серця та високого кров'яного тиску, а також знижує психологічне здоров'я (1). Ожиріння, як правило, лікується дієтою та фізичними вправами, але спроби підтримати значну втрату ваги дієтами та фізичними вправами майже завжди зустрічаються з невдачею (6). Існує велика потреба у розробці кращої фармакотерапії ожиріння (18). Тут ми розпочинаємо оцінку потенційного використання AOD-9401, фрагмента гормону росту людини (hGH), для лікування ожиріння.

Це дослідження має на меті розширити ці висновки, дослідивши, чи може пероральне введення цього фрагмента гормону росту збільшити масу тіла та вплинути на ліпідний обмін. Це дослідження складалося з трьох частин. Спочатку ми досліджували ефективність перорального введення AOD-9401 щодо зменшення маси тіла, енергетичного балансу, ліполізу та ліпогенезу при ожирінні C57BL/6J (об/об) миші. Потім ми дослідили антиліпогенну, ліполітичну та жироокислювальну активність AOD-9401 у периферичних жирових тканинах гризунів із ожирінням in vitro. Нарешті, для оцінки доцільності лікування людини досліджували дію AOD-9401 in vitro на ліполіз та ліпогенез у жировій тканині із жирової жирової тканини людини, що страждає ожирінням.

Хімічний синтез функціонального домену hGH (AOD-9401).

AOD-9401, синтетичний фрагмент гормону росту, що складається з амінокислотних залишків 177–191, був приготований за твердофазною процедурою синтезу та очищений методом зворотної фази ВЕРХ у наших лабораторіях університету Монаша (9). Структуру пептидного аналога перевіряли за допомогою мас-спектрометрії та аналізу амінокислот.

Тести in vitro на неферментну та ферментативну деградацію AOD-9401.

AOD-9401 тестували на стійкість in vitro проти потенційної деградації шлунково-кишкового тракту, згідно зі стандартними протоколами перетравлення ферментів для білка (26). Процедура De Laureto та співавт. (4) використовували для оцінки швидкості деградації шляхом вимірювання залишкового пептиду за допомогою методів RP-HPLC, а також аналізу амінокислот.

Експериментальні тварини та пероральне лікування.

Вісімнадцять чоловіків C57BL/6J (об/об) у цьому дослідженні використовували мишей віком 10–12 тижнів та вагою 46,4 ± 1,1 (SE) г. Тварин поділяли на сольові розчини ( = 8) або групи лікування AOD-9401 ( = 10) і відповідали вазі тіла та статі. Тварин поселяли у звичайному 12: 12-годинному циклі світло-темряви при постійній кімнатній температурі 23 ° C у Департаментському будинку для тварин при Університеті Монаша. Тварин годували за бажанням стандартною лабораторною неочищеною дієтою (Кларк Кінг, Мельбурн, Австралія), і їм завжди дозволявся вільний доступ до води. Мишам давали щоденні пероральні дози або AOD-9401 (500 мкг/кг маси тіла), розчиненого в 0,3 мл фізіологічного розчину, або лише фізіологічного розчину з еквівалентним об'ємом протягом 30 днів. Точному дозуванню сприяла голка з нержавіючої сталі (діаметр 7,5 × 0,1 см). Дозу вводили повільно, щоб уникнути рефлюксу.

Вимірювання збільшення маси тіла, споживання їжі, витрат енергії та фізичної активності.

Вагу тіла мишей вимірювали перед лікуванням, а потім кожні 2 дні до кінця дослідження. Споживання їжі вимірювали кожні 2 дні після початку лікування та усереднювали для щоденного вимірювання. Грами спожитої неочищеної дієти множили на 2,85, щоб отримати споживання калорій в кілокалоріях на день, а потім помножили на 4,184, щоб перетворити на кілоджоулі на день. Витрати енергії вимірювали в кінці періоду обробки непрямим калориметром (Columbus Instruments, Columbus, Ohio).

Гравіметрично визначені стандартні газові суміші 20,48% O2 та 0,5% CO2 використовували для калібрування машини перед використанням (BOC Gases Australia, Preston, Victoria, Australia). Після пробірки мишей голодували протягом 2 год, а потім поміщали в коробку Perspex розміром 20 × 13 × 11 см, через яку всмоктували свіже повітря зі швидкістю 0,65 л/хв. Середні норми виробленого СО2 та спожитого O2 розраховували кожні 3 хв протягом 30-хвилинного періоду. Норми витрат енергії (ккал/хв) були розраховані на основі даних за останні 15 хв, припускаючи екскрецію азоту з сечею 0,84 мг · хв −1 · кг маси тіла −1 (27). Протягом останніх 3 днів періоду лікування у цих мишей також вимірювали добровільний рівень фізичної активності за допомогою бігових коліс діаметром 15 см. Постійний цілодобовий моніторинг використання ходових коліс проводився за допомогою комп'ютеризованого лічильника (7).

Гострий вплив AOD-9401 на окислення жиру in vivo.

Гострий вплив AOD-9401 на швидкість окислення жиру та глюкози оцінювали в кінці 30-денного періоду перорального лікування страждають ожирінням об/об миші після прийому їжі, фізичної активності та споживання енергії в стані спокою були завершені. Вранці останнього дня дослідження групу з трьох мишей, оброблених сольовим розчином, та чотирьох мишей, оброблених AOD-9401, позбавляли їжі протягом 1 години; потім вимірювали базальне окиснення жиру, окислення глюкози та витрати енергії протягом 10 хв за допомогою процедури непрямої калориметрії, описаної раніше. Потім мишам робили внутрішньочеревну ін’єкцію фізіологічного розчину (у групі, обробленій фізіологічним розчином) або AOD-9401 (250 мкг/кг у групі, яка отримувала АОД), і вимірювали швидкість окислення жиру, окислення глюкози та енергетичні витрати ще 18 хв.

Виділення жирових тканин.

Групи мишей вбивали летальною дозою пентобарбітону (0,2 мл) через 24 год після останньої обробки пероральним AOD-9401 на день 30. Вимірювання енергетичних витрат після внутрішньочеревного дозування AOD-9401 на цих мишах не проводили. Епідидимальні жирові прокладки від мишей-самців були виділені, як і в наших попередніх дослідженнях (14). Тканини промивали сольовим розчином кімнатної температури перед зважуванням на шматочки ∼ 200 мг для аналізів ex vivo. Для аналізів in vitro, чоловіки C57BL/6J (об/об) використовували мишей. Самців щурів Цукерів (200–300 г, вік 12 тижнів) використовували для оцінки швидкості окислення жиру в жировій тканині in vitro у відповідь на AOD-9401. Підшкірну жирову тканину черевної порожнини людини було отримано за згодою пацієнта із надмірною вагою (вік: 42 роки; індекс маси тіла: 28,4), який не мав інших відомих медичних ускладнень і який переніс операцію зі зменшення жиру з косметичних причин.