Вплив солі на гіпертонію та окислювальний стрес у американської моделі ожиріння, спричиненого дієтою, на щурах

Департамент фізіологічних наук, медична школа Східної Вірджинії, Норфолк, Вірджинія 23507

Анотація

Тварини

Усі процедури за участю тварин були схвалені Інституційним комітетом з догляду та використання тварин Східної Вірджинії. Вісімнадцять самців щурів SD (300–350 г), що знаходились в клітці в окремі клітини, були випадковим чином обрані для годування дієтою з помірним вмістом жиру (MHF) з 0,8% натрію (32% ккал у жирі, Research Diets, New Brunswick, NJ), тоді як шість щурів (контролі) годували очищеною дієтою з низьким вмістом жиру (LF) з 0,8% натрію (10,6% ккал як жир, Дієти досліджень) протягом 10 тижнів. Ідентичну кількість щурів поміщали на дієти MHF та LF, кожна з яких містила або 2, або 4% натрію (дієти з високим вмістом солі). Продовольство та вода забезпечувались за бажанням протягом усього експерименту. Вага тіла та довжина тіла вимірювались спочатку, а потім щотижня разом із споживанням їжі. Щури, котрі годували МХФ дієтою як з низьким, так і з високим вмістом солі, розділялись на окремі групи на основі приросту BW. Віднесення щурів до рівня ожиріння (OP) ( = 8) та стійкий до ожиріння (АБО) ( = 8) групи проводили, як описано раніше (12).

Систолічний АТ

Початок та розвиток гіпертонії оцінювали за допомогою методу хвостової манжети за допомогою електро-сфігноманометра Narco Biosystems (Х'юстон, Техас). АТ вимірювали в свідомих умовах на початку експерименту та на 1, 5, 8 та 10 тижнів дієти. Для кожного вимірювання реєстрували середнє значення п'яти показань тиску.

Оцінка окисного стресу

Продукцію супероксидних аніонів вимірювали в ізольованих аортальних кільцях за допомогою методу, описаного раніше (12, 21). Коротко, 5-мм аортальні кільця попередньо інкубували в буфері Кребса-бікарбонату при 37 ° C протягом 30 хв, а потім переносили в коктейль, що містить 5 мкмоль/л люцигеніну, і негайно вимірювали кожні 2 хв протягом 15 хв, використовуючи сцинтиляційний лічильник, встановлений у режимі випадковості. Показники були побудовані в графіку та інтегрована площа під кривою. Результати нормалізували на міліграм ДНК, виміряні за допомогою барвника Hoechst 33258, як описано (27). Специфічність реакції перевіряли на здатність 50 Од/мл СОД гасити хемілюмінесценцію в кінці вимірювання.

Вільний 8-ізопростан F2α. Ізопростани вимірювали за допомогою ОВН за допомогою набору від Cayman Chemicals, як описано раніше (12). Сеча, зібрана в метаболічних клітинах протягом 24-годинного періоду, була доповнена 0,05% бутильованим гідрокситолуолом і додана 8- [3 H] ізопростану. Зразки (1 мл) пропускали на споріднену колону (Cayman Chemicals), і лише вільні ізопростани елюювали з використанням 95% метанолу. Елюат випарювали насухо під потоком N2 і гранулу ресуспендували в 1-мл пробному буфері. Кожен зразок аналізували у двох примірниках у двох різних розведеннях та коригували на індивідуальне відновлення 8- [3 H] ізопростану, і результати усереднювали. Нітрат/нітрит аналізували як у плазмі, так і в сечі (розведений 1:50 у PBS) за допомогою колориметричного методу LDH з набором від Cayman Chemicals.

Імуногістохімія для 4-гідрокси-2-ноненалу. Нирки фіксували у 10% забуференному формаліні протягом 3 год і вкладали парафін. Зрізи інкубували з поліклональними антитілами, що розпізнавали аддукти Cys, His, Lys-4 гідрокси-2-ноненального “Майкла” (Calbiochem, розведення 1: 750). Потім предметні стекла реагували з біотинільованими вторинними козячими анти-кролячими антитілами (розведення 1: 500; Vector Laboratories, Burlin-game, CA), з реагентом ABC-Elite avidin (Vector Laboratories) і, нарешті, з DAB Imhano Pure Metal Enhanced DAB Набір основи (Пірс, Рокфорд, Іллінойс).

Гіпертрофія судин та склероз нирок

Площа стінки аорти. Тонкі зрізи вкладеної в парафін тканини фарбували протягом 1 хв толуїдиновим синім та аналізували, як описано раніше (10).

Гістологія нирок. Нирки фіксували у 10% забуференному формаліні протягом 4 год і закладали у парафін. Зрізи фарбували за допомогою реактиву періодичної кислоти-Шиффа (PAS) і фарбували гематоксиліном. Щоб оцінити ступінь сегментарного склерозу, троє незалежних дослідників досліджували слайди сліпо, змішуючи слайди після покриття номерів протоколів. У кожному випадку 80-100 клубочків досліджували для кожного предметного стекла та індивідуально оцінювали за шкалою від 0 до 2+ відповідно до ступеня склерозу клубочків. 0 клас був нормальним на вигляд клубочком; клас 1+ характеризувався м’яким розширенням мезангіального матриксу, відсутністю оклюзії в капілярах клубочків або прилипання до капсули Боумена; і клас 2+ включало розширення мезангіального матриксу, зазвичай фокального з адгезією до капсули Боумена та певним ступенем закупорки капілярів. Оцінка, що представляє суму оцінок, була отримана для кожного щура.