Вправи послаблюють транскрипційну активацію метаболічних генів у скелеті, спричинену голодуванням

Лабораторія Джона Б. Пірса,

Кафедра клітинної та молекулярної фізіології, Медичний факультет Єльського університету, Нью-Хейвен, Коннектикут 06519

Анотація

Голодування викликає поступове посилення ліпідного обміну в скелетних м’язах. Для визначення ефекту голодування на транскрипційну регуляцію генів, важливих для метаболічного контролю в скелетних м'язах, що складаються з різних типів клітковини, ядра контрольних та натщесерцевих (24 та 72 год) щурів піддавали аналізу ядерного запуску за допомогою RT-PCR -заснована техніка. Пост збільшився ( скелетні м'язи, завдяки своїй масі та загальній енергетичній потребі, є основною тканиною, яка відповідає за очищення дієтичної глюкози та ліпідів від кровообігу і, таким чином, відіграє ключову роль у підтримці загального метаболічного гомеостазу (33, 42). Зростаюче визнання того, що тонкі зміни в енергетичному балансі, якщо розглядати їх протягом тривалого періоду часу, представляють значний фактор ризику розвитку таких метаболічних відхилень, як резистентність до інсуліну, гіпертригліцеридемія, ожиріння та інсулінонезалежний цукровий діабет, посилили пошук для специфічних клітинних сигнальних та регуляторних білків, які можуть впливати на метаболічний контроль у скелетних м’язах (32).

Більшість успіхів у нашому розумінні того, як гострі виклики посередницькому метаболізму можуть бути сприйняті та реагувати на них на молекулярному рівні, виникли внаслідок роботи в печінці, нирках та жировій тканині. Наприклад, перехід із режиму годування в стан натщесерце різко активує транскрипцію ряду генів, що кодують ферменти, з обмежувальною швидкістю в печінковому глюконеогенезі, окисленні жирних кислот та кетогенезі. За допомогою молекулярних досліджень на трансгенних мишах та різних системах клітинних культур детальна характеристика регуляторних елементів у промоторних областях цих генів призвела до ідентифікації ключових сигнальних білків та факторів транскрипції, які реагують на різні харчові та/або гормональні маніпуляції (13, 19,30).

Матеріали.

Самців щурів Спраг-Доулі виводили власними силами або купували у лабораторії Чарльз Рівер (Вілмінгтон, Массачусетс). Усі щури розміщувались індивідуально в кімнаті з температурою (22 ° C) і світлом (темно з 9:00 до 21:00), і їм надавали вільний доступ до їжі (дієта для гризунів Purina) і води. Радіомарковані сполуки були придбані у Amersham Pharmacia Biotech. Всі інші хімічні речовини були молекулярно-біологічного класу і були придбані у Boehringer Mannheim, GIBCO-BRL, Promega або Sigma Chemical.

Експериментальний дизайн.

На момент кожного експерименту щури важили 340–360 г. На початку темного циклу (9:00 ранку) у експериментальних щурів видаляли їжу і затримували її на 24 або 72 год, зберігаючи вільний доступ до води. Контрольні щури продовжували мати вільний доступ до їжі та води. У другому наборі експериментів метаболічний попит збільшувався під час голодування (24 год), коли щури виконували два 2-годинні вправи бігової доріжки (18 м/хв, нахил 5 °), починаючи через 1 та 6 год після видалення їжі (тобто, 10:00 та 15:00). Щурів вбивали на позначці 24 години (~ 16 год після останнього вправи) і порівнювали з додатковими контрольними щурами, що голодували 24 години. По завершенні експериментів щурів знеболювали (35 мг/кг внутрішньовенно пентобарбіталу натрію) і поміщали на грілку для підтримки температури тіла під час операції.

Ізоляція ядер.

Визначення швидкості транскрипції методом RT-PCR.

RT зароджуваної РНК проводили за допомогою Superscript II RNase H - системи (GIBCO-BRL) відповідно до інструкцій виробника. Коротко, 18 мкл РНК змішували з 1,5 мкл оліго (dT) 12–18 (500 нг/мкл), нагрівали до 70 ° С протягом 10 хв і швидко охолоджували на льоду протягом 5 хв. Після спінінгу конденсації 6 мкл 5-кратного реакційного буфера (250 мМ Трис, рН 8,3, 375 мМ KCl і 15 мМ NaCl), 3 мкл 0,1 М DTT і 1,5 мкл dNTP суміші (по 10 мМ dATP, dCTP, dGTP та dTTP) були додані до кожного зразка. Після 2-хвилинної попередньої інкубації при 42 ° C додавали 1,0 мкл Суперскрипту II і зразки інкубували при 42 ° C протягом 50 хв. Фермент інактивували інкубацією при 70 ° С протягом 15 хв. Щоб врахувати відмінності у вмісті ядер серед зразків перед запущеною реакцією, продукти RT розбавляли безнуклеазним H2O на основі відносного вмісту геномної ДНК у кожному препараті ядер (див. Нижче). Середній об'єм був встановлений на рівні 150 мкл.

Таблиця 1. Праймери та умови реакції, що використовуються для ПЛР на ядерній РТ-РНК

UCP3, роз'єднуючий білок 3; LPL, ліпопротеїн-ліпаза; CPT I, карнітинпальмітоїлтрансфераза I; LCAD, довголанцюгова ацил-КоА дегідрогеназа; MCAD, середньоланцюгова ацил-КоА дегідрогеназа; HK II, гексокіназа II; [MgCl2], концентрація MgCl2; AT, температура відпалу.

Виділення та кількісне визначення геномної ДНК.

Щоб виправити початкові відмінності вмісту ядер серед зразків, геномну ДНК виділили з частини кожного зразка ядер того самого дня, коли відбулася реакція ядерної обкатки. 20-мкл аліквоти ядер поміщали в 380 мкл травного буфера (10 мМ Трис, рН 8,0, 100 мМ NaCl, 25 мМ ЕДТА, 0,5% SDS та 100 мкг протеїнази К) та інкубували при 50 ° С протягом ∼ 6 год. Після додавання додаткових 380 мкл безнуклеазної H2O ДНК виділяли екстракцією рівним об'ємом фенол-хлороформ-ізоаміл OH (25: 24: 1), розділяючи центрифугуванням (12000 g, 4 ° C) і випав з одержаної водної фази додаванням 1 10 об. 3 М NaOAc -, 100 мкг тРНК (для полегшення візуалізації гранул ДНК) і 2,5 об.% 100% EtOH. ДНК гранулювали (12000g, 10 хв, 4 ° C), промивали 70% EtOH і ресуспендували в 50 мкл 10 мМ трис та 1 мМ EDTA (ТЕ, рН 8,0) протягом ночі при 4 ° C. Відносне кількісне визначення геномної ДНК (початковий вміст ядер) визначали методом ПЛР-ампліфікації гена β-актину. Ці дані використовувались для коригування кінцевих розведень відповідних продуктів реакції RT із ядерних обтікаючих реакцій (до ПЛР, див. Вище) для врахування невеликих відмінностей у початковому вмісті ядер у зразках.