Втрата функції Aif спричиняє загибель клітин у зародка миші, але тимчасове прогресування
Автор: Гейл Р. Мартін, 12 травня 2006 р
↵ ‡ Д.Б. та B.D.Y. внесли однаковий внесок у цю роботу.
Анотація
Клітинна смерть відіграє ключову роль як у станах захворювання, так і в нормальному розвитку. Однією з найбільш ранніх подій в ембріогенезі мишей, формуванні проамніотичної порожнини, є процес, залежний від апоптозу (1). Поки що мало відомо про молекулярні механізми, що регулюють нормальний апоптоз в ембріоні ссавців. Інактивація окремих генів у шляху каспази, які вважаються основними ефекторами загибелі клітин, не перешкоджає нормальній загибелі клітин у ранньому ембріогенезі (2). Навпаки, повідомляється, що інактивація Pcdc8, гена, що кодує фактор, що викликає апоптоз (AIF), блокує кавітацію в зародкових тілах (3), модель in vitro для формування проамніотичної порожнини (1). Ці дані свідчать про те, що функція Aif є важливим посередником нормального апоптозу в ранньому ембріогенезі мишей.
Вперше AIF було визначено як мітохондріальний білок, який може індукувати зміни, характерні для апоптозу в ізольованих ядрах. Миші Aif миші та людини є X-пов'язаними та кодують висококонсервативні білки, які мають значну гомологію з бактеріальними NADH-оксидоредуктазами. У здорових клітинах повсюдно експресований білок AIF обмежений мітохондріями. Однак після обробки препаратами, що індукують апоптоз, AIF можна виявити в цитозолі та ядрі (4). На основі цих та інших даних було запропоновано, що AIF має функцію акцептора/донора електрона (оксидоредуктаза) та другу, незалежну апоптогенну функцію (5). Таким чином, AIF має спільні риси з цитохромом с, який бере участь у електронній човниковій взаємодії між комплексами дихальних ланцюгів (RC) в мітохондріях і стає ефектором загибелі клітин після вивільнення в цитозоль апоптотичними стимулами. Однак тоді як вважається, що цитохром с здійснює свою апоптогенну дію в цитозолі, беручи участь в активації кас-каз кату (6), схоже, АІФ здійснює свою апоптогенну дію безпосередньою взаємодією з ДНК (5), тим самим функціонуючи через каспазу- незалежний шлях.
Гіпотеза про те, що AIF опосередковує загибель клітин у ранніх ембріонах, до цього часу не була перевірена генетично. Початкові спроби продукувати нульових мишей Aif шляхом генного націлювання не увінчалися успіхом, оскільки чоловічі клітини ES, що несуть нульовий алель Aif у своїй одиничній Х-хромосомі, не змогли сформувати химерних мишей після ін'єкції в бластоцисти хазяїна. Потенційним поясненням цього спостереження є те, що наявність клітин Aif -/Y ES, які не можуть зазнати нормального апоптозу, перешкоджало розвитку химерних ембріонів (3). Тут ми досліджуємо функцію Aif в нормальному ембріогенезі, використовуючи Aif flox, нещодавно описаний умовний нульовий алель Aif, в якому екзон 7 оточений сайтами loxP. Тому опосередкована Cre-рекомбінацією видаляє нуклеотиди 694-778, порушуючи тим самим рамку зчитування (7). Наші дані забезпечують докази того, що Aif не потрібен для апоптозу на ранніх стадіях розвитку, а, натомість, необхідний для виживання клітин, починаючи приблизно з 9 ембріонального дня (E9). Смерть клітини, спричинена втратою функції Aif, призвела до інтригуючого фенотипу, який продемонстрував, що формування форми у миші може відбуватися незалежно від розміру ембріона та кількості клітин.
Результати
Функція Aif не потрібна для апоптозу в ембріоїдних тілах або ранніх мишачих ембріонах.
Хоча ці дані залишали відкритою можливість того, що здатність до кавітації може бути зумовлена стійкістю материнського білка AIF, що виробляється в ооциті до запліднення, вони настійно припускають, що функція Aif не потрібна для формування проамніотичної порожнини під час ембріогенезу. Для подальшого вивчення цього питання ми прагнули визначити, чи нульові Aif похідні бластоцисти ES-клітини, які зазнали ≈20 подвоєнь для розведення будь-якого залишкового білка AIF, утворюватимуть ембріоїдні тіла, які кавітавали. Тому ми встановили нові клітинні лінії ES з потомства схрещування між самками Aif flox/flox або Aif flox/+ та β-Ac-cre Tg/Tg самців. З 48 культивованих бластоцист ми отримали 32 клітинні лінії ES, 14 з яких несли Y-хромосому. Половина цих чоловічих клітинних ліній ES несла рекомбінований алель Aif (нуль) і не містила білка AIF (рис. 1 B і C, а дані не показані). Швидкість клітинної проліферації була однаковою для всіх нульових, гетерозиготних та диких типів клітинних ліній ES типу Aif під час їх встановлення та подальшого збереження в культурі (дані не наведені).
Щоб дослідити, чи потрібен AIF для нормальної загибелі клітин на більш пізній стадії ембріогенезу, ми дослідили нульові ембріони Aif приблизно на рівні E8,5 [8–9 стадія соміту (сом)], коли нормальні ембріони демонструють загибель клітин на стику нервової пластинки та поверхнева ектодерма під час закриття нервової трубки. У нульових ембріонах Aif, зібраних на цій стадії, бракувало білка AIF, як показав Вестерн-блот-аналіз нульових ембріонів Aif на більш ранній стадії (0 сом; рис. 1 B і C), і їх морфологічно не можна було відрізнити від односельчан дикого типу. Ми спостерігали подібний розподіл TUNEL-позитивних клітин у зародках дикого типу та нульових Aif (рис. 1 F – I), демонструючи, що на цій стадії нормальна апоптотична загибель клітин може відбуватися за відсутності AIF.
Втрата функції Aif спричиняє велику загибель клітин, починаючи з Е9, але ембріональний малюнок є нормальним.
До E9 нульові ембріони Aif можна було відрізнити від їх однолітніх диких типів. Хоча розмір переднього мозку та сомітів все ще був нормальним, трохи зменшився (рис. 2 А). Зі збільшенням терміну вагітності ці відмінності стали більш вираженими, і нульові ембріони Aif були помітно меншими, ніж ембріони дикого типу на тій же сомітній стадії (рис. 2 B – D). Приблизно на рівні E11,5, декілька досліджених нульових ембріонів Aif були мертвими. Щоб визначити причину різниці у розмірі, ми зібрали нумічний та дикий тип ембріонів Aif, що відповідає стадії соміту, дисоціювали їх та визначили загальну кількість клітин на ембріон. Нульові ембріони Aif у 20–21 сом містили лише ≈ 1/3 стільки клітин, скільки їх однолітки дикого типу. Протягом наступних 10 сомів (≈20 год) загальна кількість клітин у нульових ембріонах Aif збільшилась лише на ≈40%, порівняно з ≈500% у диких типів підстилки (рис. 2 Д). Візуальний огляд клітин дисоційованих ембріонів та аналіз розсіювання вперед показали, що клітини мутантних ембріонів були подібними за розміром (діаметром) до нормальних клітин (дані не наведені). Таким чином, малий розмір нульових ембріонів Aif, здається, обумовлений, головним чином, меншим числом клітин.
Середня кількість пар сомітів (± SD) ембріонів, зібраних у різні дні гестації від схрещування, що дає як нульові, так і дикі ембріони
Щоб визначити, чому нульові ембріони Aif не змогли вирости, ми провели аналіз на включення BrdU в різні тканини при 20-25 сомах. Значної різниці у відсотках мічених клітин не виявлено між нульовим Aif та ембріонами дикого типу (табл. 2), що свідчить про те, що знижена швидкість проліферації клітин не була основною причиною низької кількості клітин у нульових ембріонах Aif. Однак аналізи TUNEL у 24-25 сомів показали значну аномальну загибель клітин у нульових ембріонах Aif (рис. 3 A та B). Ці спостереження пояснюють загальне зменшення кількості клітин у нульових ембріонах Aif. Незрозуміло, чому аномальної загибелі клітин не було виявлено у мутантних ембріонів на більш ранніх стадіях соміту (наприклад, 8–9 сом; рис. 1 H та I), хоча Aif був інактивований у всіх клітинах 64-клітинною стадією та білком AIF не було виявлено при 0 с (рис. 1 С, а дані не показані).