Адипогенез при ожирінні вимагає тісної взаємодії між диференціюючими адипоцитами та стромальними клітинами
Анотація
ЦІЛЬ - Розширення маси жирової тканини, яке спостерігається при ожирінні, включає як гіперплазію, так і гіпертрофію адипоцитів. Однак мало відомо про те, як адипоцити, попередники адипоцитів, кровоносні судини та стромальні клітини взаємодіють між собою для досягнення адипогенезу.
ДИЗАЙН ДИЗАЙН І МЕТОДИ - Ми розробили метод конфокальної мікроскопії тривимірної візуалізації інтактної живої жирової тканини, що дозволило нам одночасно оцінити ангіогенез та адипогенез у мишей db/db.
РЕЗУЛЬТАТИ - Ми виявили, що диференціація адипоцитів відбувається в клітинних кластерах (які ми назвали адіпогенними/ангіогенними клітинними кластерами), які містять кілька типів клітин, включаючи ендотеліальні клітини та стромальні клітини, які експресують CD34 та CD68 та зв'язують лектин. Існували тісні просторові та часові взаємозв'язки між утворенням кровоносних судин та адипогенезом, і проростання нових судин із існуючої судинної системи було пов'язане з диференціацією адипоцитів. CD34 + CD68 + лектинзв'язуючі клітини можна було чітко відрізнити від CD34 - CD68 + макрофагів, які були розсіяні в стромі і не зв'язували лектин. Адипогенні/ангіогенні скупчення клітин можна морфологічно та імуногістохімічно відрізнити від коронкоподібних структур, які часто спостерігаються на пізніх стадіях ожиріння жирової тканини. Введення антитіл проти судинного ендотеліального фактора росту (VEGF) пригнічувало не тільки ангіогенез, але й утворення адипогенних/ангіогенних кластерних клітин, вказуючи на те, що зв'язок адипогенезу та ангіогенезу є важливим для диференціації адипоцитів при ожирінні і що VEGF є ключовим медіатором цього процесу.
ВИСНОВКИ - Методи візуалізації живої тканини дають нові докази динамічної взаємодії між диференціюючими адипоцитами, стромальними клітинами та ангіогенезом у жировій жировій жировій тканині.
ДИЗАЙН ДИЗАЙН І МЕТОДИ
Розширена версія розділу проектування та методів дослідження доступна в Інтернет-додатку «Матеріали та методи» (доступний за адресою http://dx.doi.org/10.2337/db06-1749).
Візуалізація живої тканини.
8-тижневих мишей db/db розділили на дві групи: групу db/db + фактор росту судинного ендотеліального фактора (VEGF) (якій підшкірно вводили моноклональне антитіло проти VEGF [100 мкг/мишу] протягом 2 років. тижнів до експерименту) та контрольної групи db/db (яка отримувала неспецифічний IgG).
Мишей вбивали вивихом шийки матки, після чого епідидимальний жир видаляли стерильними методами та подрібнювали на невеликі шматочки (~ 2–3 мм) за допомогою скальпеля. Потім шматочки тканини промивали та інкубували з FM1-43, BODIPY, ацетильованим ЛПНЩ, кон'югованим з Alexa Fluor, або ізолектином Griffonia simplicifolia GS-IB4, кон'югованим з Alexa Fluor. Ядра були забруднені Hoechst 33342.
Як повідомляється, ізолектин Griffonia simplicifolia IB4 є корисним гістохімічним зондом, який специфічно позначає ендотеліальні клітини багатьох видів та тканин, включаючи жирову тканину (19). Ми підтвердили ці висновки подвійним фарбуванням жирової тканини анти-CD31 (молекула адгезії тромбоцитів/ендотеліальних клітин) та лектином, що дало однакові схеми фарбування (Інтернет-додаток, рис. 1).
Всі експерименти були схвалені Комітетом етики університетів Токіо для експериментів на тваринах і суворо дотримувались рекомендацій щодо експериментів на тваринах Токійського університету.
Конфокальна мікроскопія.
Використовували конфокальний лазерний скануючий мікроскоп (CSU22; Yokogawa-denki та LSM510 Meta; Carl Zeiss). Тканину збуджували за допомогою різнокольорових лазерних ліній, і випромінювання збирали через відповідні вузькосмугові фільтри. Кожне зображення створювалось із середнього восьми кадрів, після чого отримані зображення оброблялись, щоб отримати тривимірну модель, відтворену поверхнею.
Використовуючи останнє, ми підтвердили, що кожен адипоцит в жировій тканині оточений мікросудинами з використанням штабелів товщиною 50 мкм, але нам було важко візуалізувати точні деталі структур через недостатнє фокусування на глибоких зрізах. Тому ми вирішили використовувати переважно стоси + клітин без порушення плазматичної мембрани. Показана гістограма була побудована з 1000 клітин з кожної групи. Для обчислення кількості адипоцитів в епідидимальних жирових прокладках об'єм жиру ділили на визначену кількість клітин на одиницю об'єму.
Для кількісної оцінки кількості адипогенних кластерних клітин з кожних рівних просторових інтервалів брали чотири зрізи з кожної жирової прокладки епідидимуму, а для кожного зрізу досліджували зображення п’яти полів малої потужності, забарвлених BODIPY та лектином. У кожній групі аналізували чотирьох тварин (загалом 80 полів малої потужності для кожної групи). Було визначено кількість адипогенних/ангіогенних кластерних клітин (що визначається наявністю невеликих адипоцитів, оточених лектинзв'язуючими клітинами та судинами). Ми проаналізували принаймні п’ять полів на зріз та чотири зрізи на жирову масу, щоб отримати репрезентативні зображення.
У попередніх експериментах ми підтвердили, що жирова тканина була структурно однорідною, досліджуючи жирові прокладки з рівними просторовими інтервалами в db/+, а скупчення адипогенних клітин також були однорідно розподілені по всіх зрізах, взятих з різних частин епідидимальних жирових прокладок db/db миші (Інтернет-додаток Рис. 3).
Імунофлуоресцентне фарбування включеного бромодезоксиуридину.
Мишам внутрішньочеревно вводили бромодезоксиуридин (BrdU) (30 мг/кг маси тіла) за 2 дні до вбивства. Після цього резектована жирова тканина була зафіксована, пронизана, оброблена дезоксирибонуклеазою та інкубована з кон’югованими з флуоресцеїном ізотіоціанатом антитілами до BrdU.
Імуногістохімія.
Для імуногістохімічного аналізу ізольовані шматочки тканини фіксували у 4% формальдегіді та просочували 1% Triton X-100. Потім зразки блокували 1% BSA та інкубували з парою первинних антитіл, а потім із вторинним антитілом. Антитіла, барвники, постачальники, час інкубації та концентрація, використані в цьому дослідженні, зведені в таблиці додатків в Інтернеті.