Аналоги тимідину пригнічують аутофагію та адипогенез у культивованих адипоцитах антимікробних агентах

АНОТАЦІЯ

ВСТУП

Високоактивна антиретровірусна терапія (HAART) була пов'язана з розвитком так званого "синдрому ліподистрофії" (LD) (1–3). У когортах з переважним використанням аналогів тимідину (ТА) відсоток ВІЛ-позитивних пацієнтів з діагнозом ліподистрофічний досяг рівня майже 50% (1). Поширеність ЛД залишається основною проблемою в медицині ВІЛ, враховуючи те, що аналоги тимідину все ще активно використовуються в країнах з обмеженими ресурсами (3, 4) і що ліпоатрофія демонструє лише незначну зворотність після заміни аналогів тимідину.

аналоги

Втрата периферичного жиру як частина синдрому ліподистрофії здебільшого пов’язана із застосуванням аналогів нуклеозидів, зокрема ставудину (d4T) та зидовудину (AZT) (5, 6). Підшкірна жирова тканина черевної порожнини у хворих на ВІЛ-1, інфікованих периферичною ліпоатрофією, характеризувалася підвищеним рівнем апоптозу (7, 8) та порушенням експресії адипогенних маркерів (9). Вважається, що порушення адіпогенезу, пов’язане з наркотиками, у поєднанні зі збільшенням втрати клітин призводить до атрофії жирової тканини. Використовуючи добре охарактеризовані клітинні лінії та первинні людські адипоцити, ми та інші неодноразово підтверджували антиадипогенні властивості AZT та d4T in vitro (10–15), що цілком могло мати клінічний вплив на адипогенез in vivo (16).

Ряд останніх досліджень припустив центральну роль аутофагії адипоцитів у підтримці гомеостазу жирової тканини (19–21). Генетичне та фармакологічне пригнічення аутофагії адипоцитів було механічно пов’язане із зменшенням жирової маси та порушенням адипогенезу (19–21).

Оскільки ефекти in vivo та in vitro від лікування AZT та d4T гомеостазу адипоцитів нагадують ситуацію, коли аутофагічний баланс порушений, ми висунули гіпотезу про те, що деякі антиадипогенні ефекти цих препаратів можуть бути опосередковані через їх вплив на аутофагію.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ

Генетичне пригнічення аутофагії було досягнуто за допомогою нокдауну ATG5 (shATG5), опосередкованого короткою шпилькою РНК (shRNA) (Санта-Крус). ATG5 кодує критичний аутофагічний білок, необхідний для дозрівання аутофагічної мембрани (19). CopGFP та неспецифічну рРНК використовували як засоби контролю згідно з інструкціями виробника (Santa Cruz). Трансдукцію та нокдаун виконували, використовуючи лентівірусні частинки з до п'ятьма різними конструкціями експресії. Ефективність трансдукції, визначена кількістю GFP-позитивних клітин після відбору пуроміцину, як правило, перевищувала 95%.

Аналіз впливу нуклеозидних інгібіторів зворотної транскриптази (NRTI) на клітинну аутофагічну активність. Суттєвим фактором, що враховує аналіз клітинної аутофагії, є той факт, що аутофагосоми відповідають проміжній структурі динамічного процесу і що їх загальна кількість у певний момент часу є функцією двох змінних: генерація проти зникнення (18). Отже, збільшення присутності аутофагосом може означати або індукцію, або блокування пізньої аутофагії (на етапі формування аутофагосом [AF]). Вимірювання аутофагічного потоку дозволяє розрізняти ці два сценарії (18).

Аналіз флуоресцентної мікроскопії впливу NRTI на формування аутофагосом. GFP-LC3 візуалізували за допомогою звичайної флуоресцентної мікроскопії згідно з нещодавно оновленими рекомендаціями (18). Цитоплазматичний пул GFP-LC3 було виявлено як однорідно диспергований сигнал, тоді як мічені GFP-LC3-II аутофагосоми візуалізувались як утворення пунктиків (18). Утворення експериментальних артефактів в результаті потенційних громіздких агрегатів GFP-LC3 було мінімізовано використанням стабільно трансдукованих клітин у поєднанні з відповідною селекцією клонів (18).

Для експериментів із візуалізацією живих клітин клітини 293T та 3T3-F442A, стабільно експресують GFP-LC3, вирощували на одинарних предметних стеклах. Клітини піддавали призначеним інкубаціям при 37 ° С у 5% СО2. Для кожного окремого стану лікування флуоресцентні зображення брали з кількох клітин, що належать до ряду випадково вибраних полів, за допомогою GFP-фільтра з використанням приладу Olympus IX81 та analySIS (Soft Imaging System GmbH).

Проточний цитометричний аналіз аутофагічної активності. Для вимірювання аутофагічного потоку ми скористалися нещодавно розробленим проточним цитометричним аналізом для моніторингу аутофагії в живих клітинах ссавців (18). Цей високочутливий кількісний метод заснований на моніторингу обороту традиційного автофагосомного маркера LC3, позначеного GFP, за допомогою проточної цитометрії. Активація та гальмування аутофагічної активності відповідно виявляються як залежне від часу зменшення або збільшення загального клітинного сигналу GFP (18). Активація аутофагії посилює доставку GFP-LC3 в автолізосоми, що призводить до деградації та селективного зникнення сигналу GFP (18). З іншого боку, пригнічення автофагії призводить до блокування автофагічного потоку, що призводить до накопичення GFP-LC3 і, отже, збільшення флуоресцентного сигналу (18). Інгібування аутофагії також вивчали шляхом вимірювання здатності NRTI зворотно викликати активатор зникнення сигналу флуоресценції GFP-LC3 (18).

Вимірювали проточний цитометричний аналіз аутофагічної активності клітин 293T та 3T3-F442A, оскільки субкондентуючі клітини, стабільно експресуючі GFP-LC3, інкубували в різних умовах. Клітини трипсинізували, ставили на лід та аналізували, використовуючи або FACSCalibur, або LSR II (Becton, Dickinson Biosciences), а також дані клітин, побудовані як інтенсивність флуоресценції GFP.

Внутрішньоклітинне фарбування ліпідів. Для фарбування олійно-червоним O (Sigma-Aldrich, Мюнхен, Німеччина) прикріплені клітини 3T3-F442A фіксували формальдегідом (10%), промивали і фарбували 0,21% (мас./Об.) Розчином O олії червоного (60% ізопропанолу, 40% води). Кількісне визначення вмісту триацилгліцеридів проводили після сушіння клітин та екстракції Олійно-червоного O 100% -ним ізопропанолом з подальшим фотометричним вимірюванням при 495 нм.