Атипова мікроРНК2911, кодована жимолостями, безпосередньо націлена на віруси грипу А - дослідження клітин
Предмети
Анотація
Вступ
Віруси грипу А (ВГА) становлять значну загрозу здоров’ю населення у всьому світі. У минулому столітті було три великі пандемії грипу, які спричинили високий рівень смертності, включаючи найсерйознішу пандемію в історії, зафіксовану іспанським грипом 1918 року, яка спричинила понад 50 мільйонів смертей людей 1,2. Високопатогенний підтип H5N1 та нещодавно зареєстрований підтип H7N9 показали потенціал викликати нові пандемії грипу людини 3,4,5. Висока мінливість патогенних ІАВ дозволяє їм стати стійкими до різних профілактичних методів лікування, включаючи вакцини та антитіла 6. Опеньки (HS, Lonicera japonica), добре відома китайська трава, вже тисячі років використовується для ефективного лікування грипозної інфекції. Кілька звітів показали, що відвар ГС може придушити реплікацію вірусу грипу 7,8. Однак активні сполуки у відварі ГС та механізм блокування вірусної реплікації залишаються незрозумілими.
З іншого боку, наше попереднє дослідження показало, що MIR168a, отриманий з харчових рослин, може проходити через шлунково-кишковий тракт (ШКТ) і потрапляти в кровообіг та різні органи мишей. У печінці миші рослина MIR168a націлена на білок 1-адаптера до рецепторів ліпопротеїнів низької щільності (LDL) (LDLRAP1), що призводить до підвищення рівня холестерину LDL у плазмі 9. Це дослідження відкрило шлях для вивчення фізіологічної функції екзогенних рослинних мікроРНК (miРНК) у людини та тварин. Однак наслідки екзогенної регуляції крос-королівства, опосередкованої мікроРНК рослин, і механізми, відповідальні за поглинання та перенесення рослинних мікроРНК, залишаються в основному невідомими, що підкреслює необхідність подальших досліджень. Враховуючи, що пацієнтам з грипозною інфекцією традиційно вводили відвар ГС, ми припускаємо, що рослинна міРНК у відварі ГС здатна потрапляти в організм людини через шлунково-кишковий тракт для здійснення терапевтичного ефекту. У цьому дослідженні ми показали, що рослинна мікроРНК, збагачена відваром HS, під назвою MIR2911, безпосередньо націлена на різні підтипи грипу А, як в пробірці і в природних умовах.
Результати
Рослина MIR2911 всмоктується і доставляється в легені мишам після введення відвару HS або синтетичного MIR2911
Поглинання оцінювали у мишей, яким вводили 500 мкл відвару HS (концентрація MIR2911: ∼ 0,12 пмоль/мл) шляхом одноразового годування. Базальна концентрація MIR2911 у плазмі миші становила 242,0 ± 23,8 фМ; концентрація MIR2911 у плазмі збільшилася до 517,1 ± 133,6 фМ через 3 год, досягла піку 1189,2 ± 323,1 фМ через 6 год і знизилася до 923,0 ± 189,3 фМ через 12 год після введення відвару ГС (рис. 1Е). Фігура 1F показала, що рівень MIR2911 у легенях миші постійно підвищувався, досягав пікового рівня через 6 годин і знижувався до базального рівня через 12 годин після введення. Більша частина MIR2911 у периферичній крові миші була виявлена у фракції, що містить мікровезикули, отримані з клітин (додаткові відомості, малюнок S3A), маючи на увазі, що MIR2911 у відварі HS може спочатку бути перенесений із шлунково-кишкового тракту, перефасований у MV клітини епітелію кишечника і, нарешті, секретуються в кровообіг. Дані імунопреципітації показали, що більшість MIR2911 у MV, отриманих з периферичної крові миші, були пов’язані з комплексом Argonaute 2 (AGO2) (Додаткова інформація, Рисунок S3B).
Рослина MIR2911 безпосередньо зв’язується з деякими типами ІАВ та інгібує кодовану вірусом H1N1 експресію білка PB2 та NS1, а також реплікацію вірусу H1N1 в пробірці
Рослина MIR2911 рятує індуковану вірусом втрату ваги та інгібує реплікацію вірусу у мишей, щеплених H1N1
Противірусний ефект відвару HS та MIR2911 був додатково випробуваний на мишах, інфікованих H1N1. У цьому експерименті 6-тижневим самкам мишей BALB/c вводили синтетичний MIR2911 (0,1 нмоль на день) шляхом елюювання або дозволяли пити відвар HS за один день до того, як їх щепили 10 6 вірусом EID50 H1N1. Після інокуляції вірусу мишей постійно обробляли відваром MIR2911 або HS протягом 7 днів. Як показано на малюнку 3А, миші, інфіковані H1N1 самостійно або одночасно оброблені H1N1 і ncRNA, швидко втратили ∼ 20% своєї ваги на 7-й день. На відміну від цього, як введення синтетичного MIR2911, так і постійне пиття відвару HS ефективно запобігали втраті ваги (6 EID50), в якому сайти, що зв'язують MIR2911 в гені PB2 та NS1, мутували без зміни амінокислотних послідовностей (Додаткова інформація, Малюнок S6), використовували для зараження мишей. Як показано на малюнку 3D та 3E, мутант H1N1 також спричиняв втрату ваги та мав високий вірусний титр, подібний до типу дикого типу H1N1. На відміну від цього, ні синтетичний MIR2911, ні відвар HS не впливали на втрату ваги та титр вірусу у мишей, інфікованих мутантом H1N1 (Рисунок 3D-3F).
Рослина MIR2911 інгібує вірусну реплікацію H5N1 та H7N9 в пробірці і в природних умовах і рятує смертність, спричинену щепленням H5N1
Також було перевірено інгібуючу дію синтетичного відвару MIR2911 та HS на нещодавно повідомлений вірус грипу H7N9. A/Anhui/1/2013 (H7N9), раніше виділений від пацієнта в Китаї 5, був використаний у наступних експериментах. Як показано на малюнках 4G та 4H, реплікація вірусу H7N9 в інфікованих клітинах MDCK була сильно пригнічена синтетичним MIR2911 або загальною РНК, вилученою з відвару HS (log log TCID50/ml для синтетичного MIR2911 було зменшено з 3,86 ± 0,16 до 2,80 ± 0,25 через 12 год та з 6,02 ± 0,17 до 5,13 ± 0,16 через 24 год після трансфекції; значення log TCID50/мл для загальної РНК, витягнутої з відвару ГС, було зменшено з 4,17 ± 0,08 до 2,99 ± 0,38 через 12 год та з 6,24 ± Від 0,04 до 5,49 ± 0,15 через 24 год після трансфекції). Інгібуючу дію загальної РНК відвару HS знову було скасовано шляхом спільної трансфекції з антагоміром проти MIR2911 (Малюнок 4Н). Також оцінювали вплив синтетичного відвару MIR2911 або HS на втрату ваги у мишей, інфікованих H7N9. Як показано на малюнку 4I, миші, які отримували лише вірус або H7N9 плюс ncRNA, демонстрували майже 30% або 20% втрати ваги відповідно на 8 день після зараження. Синтетичний MIR2911 частково запобігав втраті ваги, спричиненій H7N9 (
Обговорення
У традиційній китайській медицині трави зазвичай варять протягом декількох годин, щоб приготувати відвар. Прийнято вважати, що РНК буде знищена під час цього процесу. Дійсно, наші дані показали, що більшість мікроРНК (наприклад, MIR166g та MIR2914), збагачені HS, деградували під час процесу кипіння. Однак спеціальна мікроРНК, MIR2911, виявилася значною мірою інтактною в остаточному відварі HS. MIR2911, раніше повідомлялося як рослинна міРНК в Росії Populus euphratica, Нікотіана табакум і Helianthus annuus 15,16,17, є нетиповою мікроРНК, оскільки вона отримана з рибосомної РНК (рРНК) і не відповідає класичному біоРегенезу мікроРНК 18,19,20. Хоча механізм, що лежить в основі високої стабільності MIR2911 під час процесу кипіння, залишається невідомим, наші дані вказують на те, що унікальна послідовність та високий вміст ГХ можуть сприяти його стабільності. Стійкість MIR2911 до процесу кипіння або навіть обробки РНКазою була скасована після зміни послідовності та зменшення вмісту ГХ. Результати показують, що міРНК може бути важливим, потенційно ефективним, але раніше невизнаним компонентом китайських трав.