Блокада рецепторів ендотеліну А запобігає невідповідності капілярів міоцитів у серці уремічних тварин
Анотація
Багато експериментальних (1,2,3,4) та клінічних (5,6,7,8,9) досліджень підтверджують патогенетичну роль потужного судинозвужувального та мітогенного агента ендотеліну-1 (ЕТ-1) у серцево-судинних захворюваннях. Сприятливий ефект антагоністів рецепторів ET-1 спостерігається при застійній серцевій недостатності (10,11,12). На цьому тлі представляють інтерес ефекти антагоністів ЕТ-рецепторів на структуру та функції серця.
При гіпертрофії лівого шлуночка (ЛШ) кардіоміоцити, як правило, переростають свій капілярний запас (13,14,15,16), що призводить до невідповідності капілярів та міоцитів. Це було особливо добре задокументовано при хронічній нирковій недостатності як у тварин (17,18), так і у людей (19). У моделі ниркової недостатності, як відомо, генезис ШВЛ частково не залежить від підвищення АТ (20). Однак не встановлено, чи впливають антагоністи ЕТ-рецепторів на серцеву капіляризацію щодо маси лівого шлуночка (тобто співвідношення капіляр-міоцити, що є важливою детермінантою надходження кисню до кардіоміоцитів).
Оскільки є дані про те, що локальна система ЕТ активується при ГЛШ (1,2,3,4,5), ми обгрунтовували, що уремічний ЛШ Л представляв зручну модель для вивчення гіпотези про те, що селективний антагоніст ЕТА-рецепторів запобігає невідповідності капілярів-міоцитів в серцях щурів з хронічною нирковою недостатністю. З цією метою ми порівняли вплив специфічного блокатора ЕТА-рецепторів LU 135252 (та інгібітора ангіотензинперетворюючого ферменту [АПФ] трандолаприлу як контролю) на щільність довжини серцевих капілярів.
Матеріали і методи
Тварини
Протокол цього дослідження відповідає рекомендаціям щодо догляду та використання лабораторних тварин, опублікованих Національним інститутом охорони здоров’я, та затверджений місцевим етичним комітетом.
Експериментальний дизайн
Дев'ять тижнів самців щурів Спраг-Доулі (SD, 220 г; Янв'є, Ле Женест, Сент-Айленд, Франція) утримувались в окремих клітинах при постійній температурі (22 ° C) і вологості (50%) і піддавали впливу 12-годинний цикл темряви/світла. Тварини мали вільний доступ до дієти з низьким вмістом нітрозамінів (1% NaCl, порошкоподібний корм Ssniff M/R, Sniff Spezialitäten GmbH, Соест, Німеччина) та води. Через 3 дні адаптації тварин випадковим чином розподіляли на проміжну загальну нефректомію (SNX) або фіктивну операцію (підставну). Спочатку правою ниркою видаляли кестемін/діазепамову анестезію (100 мг/кг або 2,5 мкг/кг відповідно), потім ліву нирку підсумовували шляхом видалення двох третин (за вагою) контралатеральної нирки, головним чином шляхом резекції коркова тканина. Підробна операція контрольних тварин полягала в декапсуляції нирки з особливою обережністю, щоб наднирники не були пошкоджені. Через двадцять чотири години після операції тварин випадковим чином розподіляли по різних групах лікування. Було проведено два окремі експерименти.
Експеримент I: Імуногістохімічне та молекулярно-біологічне дослідження. Тварин випадковим чином розподіляли до двох експериментальних груп (по 10 тварин на групу): (1) контрольовані штучним контролем та (2) необроблені SNX. Вага тіла, споживання їжі та води та систолічний АТ визначали перед операцією та через два тижневі інтервали під час дослідження. Вимірювання АТ проводили у свідомих тварин за допомогою плетизмографії хвоста. Перед закінченням експерименту тварин поміщали в окремі метаболічні клітини та проводили 24-годинний збір сечі для визначення об’єму сечі, протеїнурії, кліренсу креатиніну та концентрації імунореактивного ЕТ-1.
Підготовка тканин. Наприкінці експерименту проводили катетеризацію черевної аорти під анестезією кетамін/діазепам (100 мг/кг або 2,5 мкг/кг відповідно) та брали зразки крові для визначення параметрів сироватки крові та плазмових рівнів використовуваних препаратів. Потім проводили ретроградну судинну перфузію крижаним NaCl при контрольованому тиску, як це докладно описано в іншому місці (21). Серця розділили на три горизонтальні зрізи та заморозили у рідкому азоті для імуногістохімії, вимірювань ПЛР та гібридизації in situ. Визначали гематокрит, креатинін сироватки крові, креатинін сечі та ренін плазми (22).
Імуногістохімія. Заморожені зрізи (5 мкм) фіксували в ацетоні при 4 ° С. Імуногістологічне фарбування проводили з використанням некон'югованого поліклонального антитіла ET-1 (Bio Trend GmbH, Köln, Німеччина). Для зменшення неспецифічного забарвлення фону зрізи інкубували протягом 20 хв при 37 ° С з фактором викривлення тканини. Потім зразки промивали сольовим розчином, забуференним трис (TBS, рН 7,6), і подавали в систему авідин-біотин. Коротше кажучи, предметні стекла інкубували з первинним антитілом у розведенні 1:25 протягом 60 хв при кімнатній температурі. Вторинне антитіло (козячий анти-кролячий імуноглобулін біотин; Biogenex, Сан-Рамон, Каліфорнія) застосовували протягом 30 хв. Потім зрізи інкубували протягом 30 хв при кімнатній температурі з надчутливим міченим лужно-фосфатазою кон’югованим стрептавідином (Biogenex). Кожен етап інкубації супроводжувався ретельним подвійним промиванням в TBS. Швидкий червоний субстрат (Dako GmbH, Гамбург, Німеччина) служив хромогеном. Згодом зрізи фарбували гематоксиліном та досліджували за допомогою світлової мікроскопії. Використовуване антитіло було перевірено на специфічність у щурів. Негативний контроль проводили, опускаючи первинне антитіло. Фарбування контрольних та SNX ділянок проводили в одному і тому ж періоді, щоб зменшити варіації інтенсивності фарбування.
Олігонуклеотиди. Ми посилили рецептор ЕТА (ET-AR) та рецептор ETB (ET-BR), використовуючи олігонуклеотиди, надані Liefeldt et al. (23). Для ET-AR ми використовували як сенсорний праймер 5′-TGGGAATGGTGGGGAATG CAACTCT-3 ′ та як антисмисловий праймер 5′-GAGCGCAGAGGTTGAGGACGGTGA-3 ′, в результаті чого продукт ПЛР довжиною 258 п.н. Для ET-BR сенсорний праймер становив 5′-TTGGAGCTGAGATGT GTAAGC-3 ′, а антисмисловий праймер - 5′-CAGTGAAGCCATGTTGATACC-3 ′, в результаті чого продукт ампліфікації становив 625 п.н. Для ET-1 сенсорний праймер становив 5′-TGGCTTTCCAAGGAGC TCC-3 ′, а антисмисловий праймер - 5′-GCTTGGCAGAAATTCCAGC-3 ′, в результаті чого отриманий фрагмент ПЛР становив 339 п.н.