Чи впливає пилкова дієта на виробництво та експресію антимікробних пептидів у

Іржі Даніглік

1 Кафедра біохімії та протеоміки білка, Центр регіону Хана для біотехнологічних та сільськогосподарських досліджень, Природничий факультет, Палацький університет в Оломоуці, Šlechtitelů 27, 783 71 Olomouc, Чеська Республіка; [email protected] (J.D.); [email protected] (R.L.); [email protected] (M.Š.)

2 Кафедра біохімії, природничий факультет, Палацький університет в Оломоуці, Шлехтітель 27, 783 71 Оломоуць, Чеська Республіка; [email protected]

Марія Шкрабішова

3 Відділ молекулярної біології, Центр регіону Хана для біотехнологічних та сільськогосподарських досліджень, Природничий факультет, Палацький університет в Оломоуці, Шлехтітель 27, 783 71 Оломоуць, Чеська Республіка; [email protected]

Рене Ленобель

Марек Шебела

Еслам Омар

4 Інститут біології, Університет Граца, Universitätsplatz 2, 8010 Грац, Австрія; ge.ude.nua@ramomalse (E.O.); [email protected] (К.Ц.)

Марек Петрживальський

2 Біохімічний факультет природничо-наукового факультету Палацького університету в Оломоуці, Шлехтітель 27, 783 71 Оломоуць, Чеська Республіка; [email protected]

Карл Крайльсхайм

4 Інститут біології, Університет Граца, Universitätsplatz 2, 8010 Грац, Австрія; ge.ude.nua@ramomalse (E.O.); [email protected] (К.Ц.)

Роберт Бродшнайдер

4 Інститут біології, Університет Граца, Universitätsplatz 2, 8010 Грац, Австрія; ge.ude.nua@ramomalse (E.O.); [email protected] (К.Ц.)

Пов’язані дані

Анотація

1. Вступ

Відсутність важливих поживних речовин у харчуванні бджіл може призвести до зменшення чисельності личинок або до ослаблення життєвого тонусу дорослих у медоносних колоніях [1]. Найбільш необхідними поживними речовинами є цукри, білки та ліпіди, що містяться в нектарі та пилку. Дорослі бджоли потребують відповідного та збалансованого харчування протягом усього життя, оскільки вони стикаються з різними завданнями та проблемами. Харчові якості пилку різняться серед видів рослин, суттєво змінюючись у загальному вмісті білків, ліпідів, цукрів та амінокислот, а також в антиоксидантній здатності [2]. Середнє споживання пилку на медоносну бджолу становить 3,4–4,3 мг/добу, причому найбільшу кількість пилку споживають бджоли-годувальниці [3]. Окрім природних джерел раціону, зібраних бджолами протягом сезону (нектар, медова роса, пилок), відомо, що різні вуглеводні дієти, які живляться колоніями як зимова їжа, викликають диференціальну експресію різних генів у жирових організмах бджіл [4].

Соціальні комахи, як правило, мають меншу кількість імуногенних генів у порівнянні з одиночними комахами [5,6]. Існує три рівні бджолиного імунітету, що відображається у їх взаємодії з патогенами - фізичні бар’єри, клітинний імунітет та гуморальний імунітет, і крім того, бджоли як соціальні комахи виробили особливий тип імунітету - соціальний імунітет [7,8]. Харчове споживання медоносних бджіл та ефективність індивідуальних імунних реакцій виявляються у можливих взаємних стосунках [9]. Гуморальна частина імунітету робочої бджоли складається з ферментів, лектинів та антимікробних пептидів (АМФ). Gätschenberger та ін. [10] показали, що загальна імунна сила літніх та зимових бджіл залишалася на одному рівні. Однак, коли бджоли сильно заражені вірусом деформованого крила, гени клітинного імунітету знижуються, тоді як експресія гуморальних імунних генів збільшується [11]. Стресові умови, викликані впливом сублетальних доз неонікотиноїдів, також порушують індивідуальну імунокомпетентність медоносних бджіл [12].

Опублікована дослідницька робота, присвячена змінам у експресії генів AMP медоносних бджіл у відповідь на специфічні стимули, в основному базується на кількісному ПЛР-аналізі тканин бджіл або цілих тіл [21,22,23]. Крім того, кілька інших методів, таких як електрофорез у поліакриламідному гелі, високоефективна рідинна хроматографія та мас-спектрометрія, були використані для виявлення та кількісної оцінки антимікробних пептидів у збірних зразках великої кількості бджіл [14,24,25]. Дослідження АМФ бджіл стосуються здебільшого змін у експресії відповідних генів, оскільки до теперішнього часу опубліковано лише декілька звітів про кількісну оцінку рівнів пептидів АМФ. Нещодавно був розроблений новий високочутливий аналітичний метод кількісного визначення ізоформ апідецину 1 у гемолімфі або частинах тіла окремих бджіл, який вважається перспективним інструментом для точної кількісної оцінки AMP бджіл [26].

Тут ми досліджували зміни у вибраних параметрах гуморальної імунної системи у окремих бджіл, яких годували різними пилковими раціонами. Ми проаналізували відносну експресію генів, що кодують апідецини та абаецин у череві медоносних бджіл, де вони синтезуються в жирових тілах. Ми також повідомляємо про перше кількісне вимірювання рівнів активних ізоформ апідецину 1 у грудях бджіл, де вони присутні в циркулюючій гемолімфі, на індивідуальному рівні бджіл, що підтримуються in vitro.

2. Матеріали та методи

2.1. Хімікати

Синтетичні стандарти апідецину 1А та ізотопно позначений [13 C6 15 N4] апідецин 1А (на С-кінці) синтезував Clonestar (Брно, Чеська Республіка). Обидва стандарти синтетичного пептиду в розчинах були кількісно визначені за допомогою аналізу амінокислот Групою аналізу білка, Центром функціональної геноміки, Швейцарським федеральним технологічним інститутом, Цюріх, Швейцарія. Ацетонітрил, метанол, вода (усі з якістю LC/MS), 98% (об./Об.) Мурашина кислота та трифтороцтова кислота приблизно. класу були від Sigma-Aldrich (Штайнхайм, Німеччина). 2-пропанол для спектроскопії був від Merck (Дармштадт, Німеччина). Всі хімічні речовини, що використовуються для кількісної оцінки експресії генів, були придбані в якості молекулярної біології.

2.2. Вирощування та годівля бджіл

Ми інкубували герметичні розводи для розплоду з кількох колоній Apis mellifera carnica від Інституту зоології, Грац, при 34,5 ° C за стандартних умов, щоб отримати нових медоносів, молодших за 24 год [27]. Бджіл вибирали випадковим чином і перемішували перед тим, як їх поміщали в експериментальні клітини, що складалися з прозорих пластикових стаканчиків. Клітки також постачали восковим батончиком і експерименти тривали протягом 18 днів. Кожна клітка містила 100 бджіл, і експеримент проводився у двох клітинах для кожного типу раціону.

2.3. Підготовка пилкових дієт та фактори харчування

Усі бджоли отримували 50% (мас./Об.) Розчину сахарози за необхідності. Усі клітини, крім однієї, додатково годувались однією з наступних білкових дієт: Feedbee TM, додаткова білкова дієта, доступна на ринку, яка не містить жодного продукту з вуликів [28], або пилок, що містить карбікули, що містить 94,8% соняшнику (Helianthus spp.), 91,2% гірчиці (Sinapis spp.), 70,6% спаржі (Asparagus spp.) або 87,6% каштана (Castanea sativa). Див. Омар та ін. [29] докладніше про дієти. Монофлорний пилок збирали бджоли в Австрії і зберігали замороженим до використання. Змішана група пилку отримувала 25% (мас./Мас.) Суміші кожного з чотирьох різних типів пилку. Кожне завантаження пилку було палінологічно проаналізовано в AGES — SPB, Abteilung, Bienenkunde und Bienenschutz, Lunz am See, Австрія та замішане у тісто, яке забезпечувалося бджолами в клітині в одній половині циліндричних 10-міліметрових пластикових трубок [27]. Усі раціони бджіл щодня оновлювались і зважувались. Середнє кумулятивне споживання дієт протягом 18 днів годування коливалося від 42,52 мг/бджола для спаржі до 68,28 мг/бджола для змішаної пилкової дієти (див. Додатковий матеріал S1).