Чутливий до тіазидів Na-Cl котранспортер - це індукований альдостероном білок PNAS

За редакцією Роберта Берлінера, Медичний факультет Єльського університету, Нью-Хейвен, штат Коннектикут, та затверджено 14 вересня 1998 р. (Отримано на огляд 5 серпня 1998 р.)

альдостероном

Анотація

Мінералокортикоїдний гормон альдостерон регулює виведення натрію з сечею, збільшуючи швидкість всмоктування натрію в нирковому епітелії (1). Широко поширена думка, що головним місцем дії альдостерону в нирках ссавців є збірний проток кори, де альдостерон регулює апікальний надходження натрію через чутливий до амілориду епітеліальний натрієвий канал (1–3). Однак результати нещодавніх досліджень мікропунктури нирок (4) та досліджень зв’язування [3 H] метолазону в мембранах кори нирок (4, 5) дозволяють припустити, що дистальний звивистий канальчик є додатковим місцем ниркових канальців мінералокортикоїдної дії. Апікальний натрій, що потрапляє в дистальний звивистий канальчик, опосередковується чутливим до тіазидів Na-Cl котранспортером (TSC) (6). Таким чином, цілком ймовірно, що передбачувані дії альдостерону на регуляцію транспорту натрію в дистальних звивистих канальцях будуть результатом регуляції шляху входу Na-Cl, чутливого до тіазидів.

Дослідженню функції та регуляції TSC сприяло недавнє клонування кДНК для котранспортера з сечового міхура камбали (7) та нирок щурів (8), що призвело до розробки молекулярних інструментів для локалізації експресії TSC. На основі експериментів із використанням гібридизації in situ (9) та зворотної транскрипції – ПЛР (10) було зроблено висновок, що мРНК TSC міститься практично виключно в дистальних звивистих канальцях нирки щурів. Імуногістохімічні дослідження з використанням антитіл до TSC, отриманих злитим білком, також продемонстрували, що експресія білка TSC у нирках щурів обмежена дистальними звивистими канальцевими клітинами (11).

Тут ми припускаємо, що альдостерон може діяти на дистальний звивистий канальчик, щоб збільшити експресію TSC дистального звивистого канальця. Для вирішення цієї гіпотези ми розробили поліклональне антитіло до TSC, отримане пептидом. Використовуючи це антитіло, ми провели експерименти з імуноблотингом та імунофлуоресценцією, продемонструвавши, що збільшення рівня циркулюючих мінералокортикоїдів, чи досягається це шляхом обмеження NaCl в їжі або введення мінералокортикоїдів, призводить до помітного збільшення експресії білка TSC у дистальному звивистому канальці. Таким чином, TSC ниркового дистального звивистого канальця представляється важливою мішенню для опосередкованого альдостероном регулювання ниркової екскреції хлориду натрію.

МЕТОДИ

Поліклональні антитіла.

Для імуноцитохімії в цих дослідженнях також використовувались моноспецифічні очищені за спорідненістю антитіла до чутливого до буметантиду Na + –K + –2Cl - котранспортера товстої висхідної кінцівки та обмінника Na + –Ca 2+, маркера сполучної трубочки. Антитіло Na + –K + –2Cl - котранспортер - це куряче поліклональне антитіло (LC20), вирощене до синтетичного пептиду, відповідного амінокислотам 33–55 котранспортера щурів, на основі послідовності, опублікованої Gamba et al. (7). Це антитіло дало повне перекриття мічення нашим раніше охарактеризованим кролячим поліклональним антитілом до Na + –K + –2Cl - котранспортеру (13) у експериментах подвійного мічення на щурах (дані не наведені). Антитілом до обмінника Na + –Ca 2+ є mAb миші (Affinity BioReagents, Golden, CO).

Тварини та експериментальні протоколи.

У цьому дослідженні використовували самців щурів Sprague – Dawley, які не містять патогенів (Taconic Farms) масою 180–220 г.

Дієтичне дослідження обмеження NaCl.

Дослідження інфузії альдостерону.

Щурів знеболювали метоксифлюраном (метофан; Пітман – Мур, Манделейн, Іллінойс) та осмотичними міні-насосами (модель 2ML2; Alzet, Пало-Альто, Каліфорнія) імплантували підшкірно для доставки 200 мкг альдостерону (Sigma) на день. Ця швидкість доставки альдостерону була обрана для досягнення рівня альдостерону в плазмі приблизно 1000 нг/дл, на основі опублікованих спостережень (16). Спочатку альдостерон розчиняли в диметилсульфоксиді і розводили ізотонічним сольовим розчином перед установкою. Контрольним щурам імплантували міні-насоси, що містять лише транспортний засіб. Кожну щура годували гельованою дієтою (приготовленою, як описано вище), забезпечуючи щоденну фіксовану кількість NaCl (58 мг/200 г БТ), деіонізовану воду (25 мл/200 г БТ) і базову чау-щур (15 г/200 г БТ) протягом усього періоду дослідження. Кількість Na у цій дієті становила 1,0 мекв/200 г ваги на добу. Після 10 днів лікування щурів вбивали для напівкількісного імуноблотінгу, як описано нижче.

Дослідження прийому флюдрокортизону.

Контрольних і оброблених щурів годували один раз на день гельованою дієтою, що містить щоденну фіксовану кількість деіонізованої води (25 мл/200 г т. Д.), NaCl (125 мг/200 г т. Д.), Основну чау-щу (15 г/200 г BW) та 0,5% агару. Для оброблених щурів флудрокортизон (Sigma) розчиняли у воді в концентрації 50 мг/л і використовували для виготовлення гелевої дієти. Доза флудрокортизону відповідала 1,2 мг/200 г БТ на добу. Після 7 днів лікування щурів вбивали для напівкількісного імуноблотінгу, як описано нижче.

Імуноблотинг.

Напівкількісний імуноблотинг проводили, як описано (17), щоб оцінити відносні рівні експресії TSC, використовуючи цілі гомогенати з цілих нирок щурів, приготованих, як описано вище в розділі «Тварини та експериментальні протоколи». Коротше кажучи, цілі нирки гомогенізували, використовуючи тканинний гомогенізатор (Omni 1000, оснащений мікропилоподібним генератором), в холодному ізолюючому розчині (pH 7,6), що містить 250 мМ сахарози, 10 мМ триетаноламіну (Calbiochem), 1 мкг/мл лейпептину (Bachem) та 0,1 мг/мл фенілметилсульфонілфториду (Біохімічна промисловість США), а загальну концентрацію білка (набір біцинхонінової кислоти (BCA); Пірс) доводили до 1,2 мкг/мкл за допомогою ізолюючого розчину. Зразки розчиняли у 5-кратному буфері зразків Леммлі (1 об. На 4 об. Проби) з подальшим нагріванням до 60 ° C протягом 15 хвилин. Початкові гелі SDS/polyacrylamide, забарвлені синім кольором Кумасі, підтвердили відповідність зразків щодо вмісту білка.

Для імуноблотингу SDS/PAGE проводили з використанням мінігелів із 7,5% поліакриламіду, а білки переносили електрофоретично в нітроцелюлозні мембрани, як описано (13). Після блокування 5 г/дл нежирного сухого молока мембрани досліджували афінно очищеним поліклональним антитілом до TSC (L573) при концентрації IgG 0,2 мкг/мл у буферному розчині антитіла, що містить 150 мМ NaCl, 50 мМ фосфату натрію, 10 мг/дл азиду натрію, 50 мг/дл Твін 20 та 1 г/дл БСА (рН 7,5). Вторинним антитілом був осличий анти-кролячий IgG, кон'югований з пероксидазою хрону (Pierce; каталожний № 31458), використовуваний у концентрації 0,16 мкг/мл. Місця реакції антитіло-антиген візуалізували за допомогою посиленої хемілюмінесценції на основі люмінолу (LumiGLO; Лабораторії Кіркегора та Перрі) перед впливом рентгенівської плівки (наукова плівка Kodak № 165-1579). Контроль проводили, як описано в результатах, використовуючи очищену за спорідненістю антисироватку, попередньо адсорбовану імунізуючим пептидом.

Характеристика анти-TSC антитіл методом імуноблотингу. (A) Імуноблот сирої мембранної фракції (17000 × g гранул із супернатанту 4000 × g центрифугування) кори нирок щурів (10 мкг загального білка на смугу), зондований або очищеними за спорідненістю анти-TSC [концентрація Ig G, 0,2 мкг/мл, ліва смуга] або те саме антитіло, попередньо адсорбоване 1 мг імунізуючого пептиду (права лінія). (B) Імуноблот, що показує регіональну локалізацію TSC у нирках щурів. Кожна смуга завантажувалася неочищеною мембранною фракцією, отриманою з кори, зовнішнього мозку (OM) та внутрішнього мозку (IM), відповідно (10 мкг загального білка на смугу). (C) Імуноблот, що показує результати диференціального центрифугування кортикального гомогенату щура, проведеного, як описано (12). Перша смуга, гранули з центрифугування при 17000 × g протягом 20 хв після початкового центрифугування при 1000 × g протягом 10 хв при 4 ° C. Друга смуга, гранули з центрифугування при 200000 × g протягом 1 години. Третя смуга, супернатант від 200 000 × g центрифугування. На кожну смугу завантажували 10 мкг загального білка. Переважна смуга 165 кДа показана у мембранних фракціях (гранули від 17000 × g та 200000 × g центрифугування), тоді як вона відсутня у цитозольній фракції (кінцевий супернатант).