Дієта впливає на бактеріальні та вільні жирні кислотні профілі кутикули Galleria mellonella

Ролі Концептуалізація, дослідження, методологія, візуалізація, написання - оригінальний проект

вільні

Приналежність Інститут паразитології Вітольда Стефаньського Польської академії наук, Тварда, Польща

Ролі Курація даних, перевірка

Приналежність Інститут паразитології Вітольда Стефаньського Польської академії наук, Тварда, Польща

Ролі Курація даних, Розслідування

Приналежність Інститут паразитології Вітольда Стефаньського Польської академії наук, Тварда, Польща

Ролі Адміністрація проекту, нагляд

Інститут паразитології Вітольда Стефаньського Польської академії наук, Тварда, Польща, BIOMIBO, Варшава, Польща

  • Міхаліна Казек,
  • Агата Качмарек,
  • Анна Катажина Вронська,
  • Мечислава Ірена Богусь

Цифри

Анотація

Цитування: Kazek M, Kaczmarek A, Wrońska AK, Boguś MI (2019) Дієта впливає на профілі бактерій та вільних жирних кислот кутикули личинок Galleria mellonella. PLoS ONE 14 (2): e0211697. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0211697

Редактор: Фабіо С. Наскіменто, Університет Сан-Паулу Факульдація філософії Ciencias e Letras de Ribeirao Preto, БРАЗИЛІЯ

Отримано: 4 липня 2018 р .; Прийнято: 19 січня 2019 р .; Опубліковано: 7 лютого 2019 р

Наявність даних: Усі дані, що лежать в основі дослідження, знаходяться в роботі та в допоміжних інформаційних файлах.

Фінансування: Цю роботу частково підтримав грант Національного центру досліджень та розробок POIG.01.04.00-14-019/12 для МІБ та Управління маршала гранту Мазовецького воєводства RPMA.01.02.00-14-5626/16. Фінансисти не мали жодної ролі у розробці досліджень, зборі та аналізі даних, прийнятті рішення про публікацію чи підготовці рукопису.

Конкуруючі інтереси: Автори заявили, що не існує конкуруючих інтересів.

Вступ

Комахи складають найчисленніший і найпоширеніший клас тварин. Їх значення для життя на землі величезне: вони відіграють важливу роль у циркуляції та розподілі органічних речовин, беруть участь у розмноженні рослин шляхом запилення та складають частину раціону багатьох хребетних тварин. Однак, незважаючи на переваги, які дарують деякі види, багато інших вважаються шкідниками чи переносниками різних хвороб [1–3].

Більша воскова моль, Galleria mellonella (порядок Lepidoptera), є членом підродини Galleriinae родини Pyralidae [13]. Це всюдисущий шкідник двох видів медоносних бджіл: Apis mellifera та Apis cerana, особливо в тропічних та субтропічних регіонах. Спочатку моль потрапляє у їхні вулики, після чого її личинки вкопуються в клітини, що містять пилок, бджолиний розплід та мед, що призводить до серйозної шкоди вулику та популяції бджіл; насправді вважається, що більша воскова моль є одним із факторів, що сприяють зменшенню чисельності домашніх та диких бджіл.

Однак личинки G. mellonella нещодавно використовувались як альтернатива хребетним як модель-хазяїн для вивчення патогенних мікроорганізмів [14–16]. Личинки пропонують багато переваг як модель-господар. Найголовніше, що їх можна підтримувати при 37 ° C, що дозволяє досліджувати мікроорганізми в температурних умовах, при яких вони є патогенними для людини-господаря. Крім того, вони дозволяють використовувати безліч варіантів для легкої доставки збудника: ін’єкція, пероральна доставка або місцеве застосування. Личинки G. mellonella також дешеві і прості в обслуговуванні. Крім того, відомо, що цей вид сприйнятливий до 29 видів грибів, семи вірусів, одного виду паразитів та 16 біологічних токсинів [16].

Основною метою цього дослідження було визначити, чи співвідношена сприйнятливість до грибкової інфекції, продемонстрована двома популяціями личинки більшої воскової молі (G. mellonella), тобто одна, яка перебуває на природному раціоні, а інша, що годується напів штучним раціоном, їх кутикулярні профілі FFA, як визначено методом GC/MS. Дослідження також досліджує бактеріальну мікрофлору на кутикулі обох популяцій G. mellonella. Важливим елементом нашого дослідження є те, що це перша перевірка впливу дієти на стійкість G. mellonella до ентомопатогенних грибів. Це дослідження не тільки надає важливу інформацію у галузі фізіології комах та імунології комах, але також є корисним посиланням для майбутніх досліджень.

Матеріали і методи

Гриб Conidiobolus coronatus

C. coronatus (Entomopthorales), ізолят номер 3491, спочатку виділений з Dendrolaelaps spp., Отриманий із колекції професора Балазі (Польська академія наук, Науковий центр сільського та лісового середовища, Познань).

Колонії грибів регулярно культивували в чашках Петрі 90 мм на агаровому середовищі Сабуро. Їх інкубували при 20 ° C протягом 12-годинного фотоперіоду (L: D 12:12), щоб стимулювати спороношення [17]. Гомогенізовані личинки G. mellonella додавали до середовища до кінцевої концентрації 10% вологої маси (SAB-GM), щоб підвищити вірулентність. Колонії грибів, використовувані для експериментів, культивували протягом семи днів.

Комахи

Дві культури воскової молі, G. mellonella (Pyralidae, Lepidoptera), вирощували у скляних камерах при 30 ° C, відносній вологості повітря 70% та у постійній темряві. Одну групу тримали на напівштучному раціоні, що складався з пшеничного борошна, пшеничних висівок, сухого молока, кукурудзяного борошна, сухих дріжджів, гліцерину, меду та води, як описано Sehnal [18]. Комах з другої групи вирощували під ті ж оптимальні умови вирощування, але годували їх натуральним бджолиним воском, взятим із природних вуликів. У кожній групі в цих умовах виводили принаймні п’ять поколінь. Досягнувши остаточної (сьомої) стадії, припинивши годування перед вступом у метаморфоз (личинки останнього віку п’яти днів, 5DL7), личинки зважували і використовували в експериментах.

Личинки 5DL7, що живляться природним та напів штучним шляхом, піддавались протягом 24 годин повністю вирощеним та спороносим колоніям C. coronatus. У кожній чашці Петрі утримували близько 15 особин, і формували контрольну групу з личинок, які протягом 24 годин піддавали дії стерильного SAB-GM. Встановлено, що це найефективніший метод зараження, який найбільше нагадує природний процес зараження [19]. Після опромінення комах переносили в нові, чисті чашки Петрі з відповідною їжею і щоденно перевіряли їх подальший розвиток. Комах, призначених для екстракції кутикулярних ліпідів, заморожували та витримували при температурі -80 ° C до аналізу.

Ідентифікація бактерій

Для ідентифікації бактерій, присутніх на кутикулі G. mellonella, п’ять личинок і 100 мл стерильного забуференного фосфатом сольового розчину (PBS) збирали в стерильну колбу об’ємом 250 мл і струшували протягом 10 хвилин. Після цього 500 мкл суспензії відбирали і культивували на чашках Петрі з колумбійським агаром, доповненим 5% овечої крові. Колонії інкубували протягом доби при 30 ° C (оптимальні умови вирощування личинок G. mellonella). Для кожної культури було проведено п’ять незалежних повторень. На наступному етапі поодинокі колонії бактерій виділяли і культивували на нових чашках Петрі з колумбійським агаром з 5% овечої крові. Знову посуд інкубували протягом 24 годин при 30 ° C. Для попереднього відбору проводили фарбування за Грамом. Мікроскопічне дослідження проводили за допомогою мікроскопа Axio Vert A1 (Zeiss) та отримання зображень за допомогою програмного забезпечення Zen (Zeiss).