Дієта з обмеженим вмістом білка під час вагітності після запліднення змінює поведінкові фенотипи
Анотація
Передумови
Епідеміологічні дослідження показують, що гіпотрофія у внутрішньоутробний період підвищує ризик психічних розладів, таких як синдром гіперактивності з дефіцитом уваги та розлад аутистичного спектра, що було експериментально підтверджено з використанням моделей на тваринах. Однак попередні експериментальні дієти з недостатнім харчуванням або з обмеженим вмістом білка (PR) впливали на інші етапи, окрім стадії плода, такі як формування яйцеклітини перед заплідненням, склад молока під час лактації та поведінка годування матері.
Результати
Ми провели запліднення in vitro та перенесення ембріонів на мишах і дозволили дієті PR та фолієвій кислоті, яка доповнює фолієву кислоту, впливати лише на середовище плода. Комплексне фенотипування нащадків PR та контрольної дієти продемонструвало помірні відмінності у поведінці страху/тривоги, пошуку новизни та просоціальної поведінки, незалежно від добавок фолієвої кислоти. Також були виявлені зміни в експресії генів та генетичному метилюванні в мозку.
Висновки
Ці результати дозволяють припустити, що епігенетичні фактори ембріона/плода впливають на поведінкові та епігенетичні фенотипи потомків. У цьому дослідженні спостерігалися значні епігенетичні зміни в мозку нащадків, викликані обмеженням материнського білка. Наскільки нам відомо, це перше дослідження з оцінки впливу гіпотрофії матері на поведінкові фенотипи за допомогою репродуктивних технологій.
Передумови
Однак дієта PR для матері впливає не тільки на середовище плода, а й на формування яйцеклітини перед заплідненням, стан харчування материнського молока та поведінку годувальниці, і тому вона може змішувати різні показники на різних етапах. У цьому дослідженні ми провели запліднення in vitro (ЕКО) для народження новонароджених, а потім отримали нащадків, усиновлених прийомними матерями до відлучення. Це дозволило дієті PR впливати лише на стадію розвитку плода.
Методи
Заява про етику експериментів на тваринах
Всі описані тут процедури були розглянуті та схвалені Інституційним комітетом з догляду та використання тварин філії Цукуба РІКЕН і виконувались відповідно до Керівних принципів догляду та використання лабораторних тварин РІКЕН (№ 10-013).
Експериментальний дизайн
Експериментальна стратегія. Коротко описана експериментальна конструкція цього дослідження. Звичайна дієта (CE-2) годувалася жінками, які використовувались для збору ооцитів, і самцями, які використовувались для збору сперми. Матері-реципієнтки споживали контрольну дієту (CD) або експериментальну дієту (PR та FA) протягом 1 місяця перед перенесенням ембріонів. Ембріони генерували заплідненням яєць спермою мишей C57BL/6J (B6). Після пологів за допомогою кесаревого розтину новонароджених робили вихованці ICR, які споживали дієти на CD, PR або FA. Після відлучення нащадків споживали контрольну дієту (CD). Сироватку відокремлювали від крові, взятої у жінок ICR. Мозкову тканину збирали у нащадків після поведінкових тестів
Експериментальні дієти
CD був дуже схожий на стандартну форму AIN93G [15]. Тестові дієти були модифіковані з рецептури AIN93G наступним чином: PR, співвідношення безвітамінного казеїну зменшилось з 20 до 5%; FA, 0,8 г/кг фолієвої кислоти додавали до PR (табл. 1). CD і PR містили 0,02% фолієвої кислоти (ваговий склад), а FA - 0,1% фолієвої кислоти (ваговий склад). Експериментальні дієти були придбані у комерційного постачальника (Oriental Yeast Co. Ltd, Токіо, Японія). Ці дієти були ізокалорійними (4 ккал/г у кожному кормі) і годувались матерями-реципієнтами за бажанням. Крім того, прийомним матерям за вигодою годували лише дієту на CD.
Усі миші, які використовувались як матері-реципієнтки та прийомні мами, а також для збору яйцеклітини та сперми, були придбані у комерційного постачальника (CLEA Japan, Inc.).
Запліднення in vitro та перенесення ембріонів
Клініко-біохімічний тест
Ми провели клініко-біохімічний тест із використанням сироватки, відібраної у жінок ICR у віці 13 тижнів. Миші споживали експериментальну дієту протягом 7 тижнів. Забір крові, відділення сироватки та аналіз проводили, як описано раніше [20]. Коротше кажучи, ми зібрали 200 мкл крові з ретро-орбітальної пазухи за допомогою піпетки Пастера (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA). Зібрану кров переносили в мікропробірку, що містить розчин коагулянта Вако (Wako Pure Chemical Industries Co, Осака, Японія), а сироватку відокремлювали центрифугуванням двічі (600–2500 ×g протягом 5–15 хв). Ми вимірювали загальний білок (TP), азот сечовини (UN), альбумін (ALB), загальний холестерин (T-CHO), HDL-холестерин (HDL-C), тригліцериди (TG) та LDL-холестерин (LD-C) в сироватці з автоматичним клініко-біохімічним аналізатором (JCA-BM2250, JEOL, Ltd., Токіо, Японія). Кількість предметів: CD, 7; PR, 7; FA, 6.
Вилучення ДНК/РНК
Ми збирали цілий мозок у дорослих чоловічих нащадків (віком 19 тижнів), які використовувались у поведінкових аналізах, аналізах метилювання та масивах експресії. Дорослі самці були евтаназовані через вивих шийки матки. Зразки мозку промивали PBS і негайно заморожували з використанням рідкого азоту. Заморожені тканини зберігали при -80 ° C. РНК і ДНК витягували одночасно за допомогою AllPrep ДНК/РНК Mini Kit (Qiagen, Валенсія, Каліфорнія, США) із цілого мозку, включаючи мозок та мозочок. Потім ми провели масиви метилювання та експресії генів, як описано нижче.