Дієтичні емульгатори безпосередньо змінюють склад мікробіоти людини та експресію генів ex vivo

Хронічні запальні захворювання пов’язані із змінами видового та геномного складу мікробіоти кишечника.

дієтичні

Вживання дієтичних емульгаторів полісорбату 80 (P80) та карбоксиметилцелюлози (CMC) призводить до поглинання мікробіоти у слиз, змін у складі мікробіоти та розвитку хронічного запалення.

Саме запалення може впливати на склад мікробіоти, що ускладнює розпізнавання того, наскільки ці сполуки діють безпосередньо на мікробіоти, на відміну від стимулювання запалення господаря, яке згодом змінює мікробіоти.

Які нові висновки?

CMC і P80 не впливають на мікробіоти кишечника, а також на господаря у мишей, що містять мікробіоти, вільні від патобіонтів.

Застосування імітатора слизової оболонки кишкової мікробної екосистеми людини (M-SHIME) виявляє, що як P80, так і CMC безпосередньо змінюють мікробіоти, збільшуючи її прозапальний потенціал.

При трансплантації мишам, що не містять зародків, суспензії M-SHIME, оброблені CMC та P80, сприяють зниженню фенотипів, пов’язаних із запаленням, що вказує на те, що безпосередній вплив цих емульгаторів на мікробіоти є достатнім для спричинення запалення та метаболічних захворювань низького ступеня.

Як це може вплинути на клінічну практику в осяжному майбутньому?

Спостереження про те, що емульгатори CMC та P80 безпосередньо впливають на мікробіоми людини таким чином, що нагадує їх вплив на мишей, підтверджує використання цієї моделі як практичного засобу для тестування харчових добавок на безпеку.

Наші результати демонструють корисність системи M-SHIME як інструменту для вивчення основних механізмів будь-яких змін хазяїна/мікробіоти.

Вступ

Отже, центральною метою цього дослідження було дослідити, якою мірою CMC та P80 можуть безпосередньо змінювати мікробіоти, використовуючи імітатор слизової оболонки кишкової мікробної екосистеми людини (M-SHIME), що дозволяє стабільно підтримувати складну мікробіоти людини в in vitro за відсутності клітин-господарів. 13-16 Ми спостерігали, що P80 і CMC змінювали мікробіоти в моделі M-SHIME таким чином, що нагадували та могли рекапітулювати їхні ефекти, що спостерігались раніше на мишах, таким чином припускаючи, що мікробіота може бути основною прямою мішенню CMC та P80.

Методи

Мишей C57BL/6 утримували в гнотобіотичних умовах у GF або зміненому стані флори Шедлера (АЧС) в ізоляторі Park Bioservices, як описано раніше. 8 C57BL/6 Rag -/- (ген, що активує рекомбінацію) мишей підтримували у специфічних без патогенів житло. Усі миші були виведені та розміщені в Університеті штату Джорджія (Атланта, штат Джорджія, США) згідно з інституційно затвердженими протоколами (IACUC № A14033). Мишей годували автоклавом LabDiet Gloud Chow # 5021 або опромінювали (20–40 кГр) очищеною дієтою з високим вмістом жиру (HFD) D12492-1.5V від Research Diet (Нью-Брансвік, Нью-Джерсі, США) (див. Додаткову онлайн-таблицю S1). В експериментах використовували як самців, так і самок мишей (порівняння всередині статі), за винятком рисунків 7 та 8, на яких використовувались миші самки. Мишей АЧС встановлювали шляхом колонізації мишей WT C57BL/6 GF повним АЧС (вісім штамів) з використанням фекалій, придбаних у АЧС Таконік (Хадсон, Нью-Йорк, США), і ресуспендували їх у питній воді.

додаткова таблиця

Вимірювання глюкози в крові натще

Мишей поміщали в чисту клітку і постили протягом 5 годин або 15 годин. Потім визначали концентрацію глюкози в крові за допомогою глюкометра Nova Max Plus і виражали у мг/дл.

Обробка емульгатором системи M-SHIME

Метатранскриптомічний аналіз M-SHIME

Трансплантація мікробіоти суспензії M-SHIME, обробленої емульгатором

Тренований карбоксиметилцелюлозою (CMC) та оброблений P80 симулятор слизової оболонки кишкової мікробної екосистеми людини (M-SHIME) сприяє посяганню мікробіоти при трансплантації мишам-реципієнтам, що не містять зародків. Була створена восьмисудинна система M-SHIME, яка була засіяна свіжими фекаліями людини в день -7. Після 7-денного періоду стабілізації посудини обробляли або водою, CMC 1%, або P80 1% протягом 13 днів. Без мікробів мишей C57BL/6 (віком 3–4 тижні) витягували з ізолятора і перорально вводили 200 мкл просвітньої суспензії M-SHIME (зразок на 11 день). Потім пересаджених мишей розміщували в ізольованих провітрюваних клітках, Ізокагестах (Techniplast). (А) Конфокальний мікроскопічний аналіз локалізації мікробіоти: Muc2 (зелений), актин (фіолетовий), бактерії (червоний) та ДНК (синій). Бар = 20 мкм. (B) Відстані найближчих бактерій до епітеліальних клітин кишечника (IEC) за умовою протягом трьох потужних полів на мишу. Дані є середніми ± SEM (N = 5). Кожну групу лікування порівнювали з контрольною групою (обробленою водою), і статистичну значимість визначали за допомогою t-критерію Стьюдента.

Статистичний аналіз

Нормальний розподіл даних оцінювали за допомогою всебічного тесту Д'Агостіно-Пірсона. Значимість визначали за допомогою t-тесту або двостороннього дисперсійного групового аналізу (ANOVA) за допомогою тесту множинних порівнянь Бонферроні (програмне забезпечення GraphPad Prism, V.6.01). Відмінності були відзначені як значні * p≤0,05 для t-тесту та # p≤0,05 для двостороннього ANOVA. Для кластерного аналізу на основних координатних ділянках категорії порівнювали, а статистичну значимість кластеризації визначали за допомогою Перманової.

Результати

CMC і P80 не впливають на кишкову мікробіоти або господаря у мишей з АЧС

Для того, щоб дослідити, якою мірою CMC та P80 можуть впливати на господаря та/або мікробіоти у мишей з обмеженою визначеною мікробіотою без патобіонтів, ми вводили CMC та P80 мишам, колонізованим виключно АЧС. Як показано на малюнках 1 і 2, ні CMC, ні P80 не мали значного впливу на діапазон параметрів господаря або мікробів у мишей АЧС. Коротко, чи оцінювали їх у глобальному масштабі за допомогою основного координатного аналізу або шляхом порівняння окремих видів (Таблиця 1), аналіз відносних рівнів восьми компонентів АЧС за допомогою q-PCR показав, що ні CMC, ні P80 не впливали на склад мікробіоти мишей АЧС, і вони не змінювались рівні фекалій Toll-подібних рецепторів (TLR) -агоністів LPS та флагеліну (фігури 1 і 2). Більше того, у мишей з АЧС введення CMC та P80 не призвело до зазіхання мікробіоти (малюнок 2L, M), розрідження слизу або особливостей слабкого запалення/метаболічного синдрому, що викликаються цими сполуками у мишей зі складною мікробіотою., ці результати суперечать думці про те, що ці емульгатори мають сильну пряму дію на господаря, а навпаки, припускають можливість того, що більш тонкі ефекти на складну мікробіоти можуть бути проксимальними медіаторами ефектів цих сполук.

Карбоксиметилцелюлоза (CMC) і P80 не впливають на склад мікробіоти кишечника у змінених мишей флори Шедлера (АЧС). Шеститижневих мишей ASF C57BL/6 піддавали впливу CMC або P80, розведених у питній воді (1,0%), протягом 11 тижнів. (A – I) Загальну фекальну ДНК екстрагували та піддавали q-PCR із використанням специфічних праймерів для 16S рРНК (A), Clostridium sp. (ASF 356) (B), Lactobacillus intestinalis (C), Lactobacillus murinus (D), Mucispirillum schaedleri (E), Eubacterium plexicaudatum (F), Firmicutes бактерія (G), Clostridium sp. (ASF 502) (H) та Parabacteroides sp. (I). Результати виражаються як кількість бактерій на мг стільця (A), використовуючи стандартну криву, або як відносні значення (B – I). (J – M) Основний координатний аналіз проводили з використанням евклідової дистанції з вісьмома членами АЧС на 6-му тижні (J), 8-му тижні (K), 10-му тижні (L) та 17-му тижні (M). Дані є середніми ± SEM (N = 3–6). Для кластерного аналізу на основних координатних ділянках порівнювали категорії та визначали статистичну значимість кластеризації методом Перманова.