Дієтичний NaCl регулює значення ниркової амінопептидази N до гіпертонії при гіпертонії щурів Даля

З секції кардіології (M.F., T.L.W., B.P.R., D.L.G., R.S.D.), Медичний факультет, Університет Іллінойсу в Чикаго, та Адміністрація ветеранів відділу Вест-Сайда (M.F., B.P.R., R.S.D.), Система охорони здоров'я Чикаго, Чикаго, Іллінойс.

Ви переглядаєте останню версію цієї статті. Попередні версії:

Анотація

Амінопептидаза N (APN) - це рясна металогідролаза в щітковій ділянці клітин проксимальних канальців нирок, яка розкладає ангіотензин III (Ang III) до ангіотензину IV (Ang IV) і поряд з дипептидиламінопептидазою деградує Ang IV. Ми дослідили вплив дієти з високим вмістом солі на активність нирок APN та кількість транскриптів у штамів щурів Sprague-Dawley та Dahl (SS/Jr). Рівень транскриптів APN та вміст білка були в 2 рази більшими ( 1 Ang III поділяє багато фізіологічних функцій Ang II у серцево-судинній та нервовій системах, включаючи стимуляцію секреції вазопресину, альдостерону та катехоламінів. 1 Подібно до Ang II, він діє як протизапальний засіб, стимулюючи вироблення цитокінів MCP-1 та активуючи NF-kB та AP-1. Постулюється, що Ang III сприяє запальній реакції та росту клітин із прогресуванням ниркової хвороби. 2,3 Однак вважається, що Ang IV має незначну біологічну активність, оскільки рецептори Ang II AT1 і AT2 мають слабку спорідненість до Ang IV, а інфузія Ang IV не викликає Ang II-залежних ефектів. 4,5 Нещодавно в кортикальних збірних протоках та мезангіальних клітинах 6 були виявлені рецептори до Ang IV, а Ang IV, на відміну від Ang III, посилював нирковий кровотік та мозкову вазодилатацію. 7 Таким чином, APN може знаходитись у критичному положенні для модуляції поглинання солі в нефронах та нирково-судинному опорі, контролюючи метаболізм Ang III до Ang IV. Ми припустили, що APN може грати механістичну роль у адаптації солі та гіпертонії.

APN є головною складовою мембран, що межують з щітками, клітин проксимальних канальців нирок та ентероцитів. 8,9 APN (номенклатура ферментів IUBMB ec 3.4.11.2, ap-n), відома також як мікросомальна амінопептидаза або амінопептидаза М, - гомодимерна, зв’язана з мембраною, цинкзалежна пептидаза, пов’язана з частинками амінопептидаза, яка переважно вивільняє нейтральні амінокислоти з N-кінцевий кінець олігопептидів і має специфічність, подібну до цитозольної лейцин амінопептидази. 10,11. APN належить до сімейства M1 клану пептидаз МА, який включає зв’язані з мембраною глікопротеїни типу II і був клонований з 6 різних видів ссавців. У цьому дослідженні ми дослідили вплив вмісту харчової солі на APN нирок у нормотензивних та чутливих до солі Даль щурів (SS).

Методи

Тварини

Протоколи використання тварин були затверджені Інституційним комітетом з питань догляду та використання тварин у Чикаго-Вест-Сайд. Самцям щурів Sprague-Dawley, Lewis та Dahl SS/Jr вагою від 250 до 300 грам, отриманих від Harlan Sprague-Dawley (Indianapolis, Ind), вводили базальну (0,3%) та високосолену (8%) щурячу дієту ( Purina серії 5500) протягом 10 днів. Для підтвердження дієти вимірювали натрій у сечі. Внутрішньоаортальні вимірювання артеріального тиску проводили, як описано раніше. Раніше повідомлялося про телеметричні вимірювання артеріального тиску за ці періоди. 12

Підготовка РНК

Нирки видаляли і швидко заморожували в рідкому азоті. Загальну РНК виділяли TRIzol (Invitrogen) з подальшим видаленням залишкових забруднень за допомогою набору RNeasy Total RNA Isolation Kit (Qiagen). Для високоякісних полі (А) + мРНК загальна РНК, підготовлена TRIzol, супроводжувалася використанням набору мРНК Oligotex (Qiagen).

Ланцюгова реакція полімерази в режимі реального часу

Ампліфікації зеленої полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) SYBR проводили, як описано раніше. 12 праймерів APN були розроблені на основі номера доступу до бази даних GenBank AFO39890 (ген APN Rattus norvegicus, екзон 2 та часткові компакт-диски) з використанням програмного забезпечення Primer Express версії 1.0 (PE Applied Biosystems) та перевірені за допомогою віртуальної ПЛР (вперед: 5 ′ TCCTGGAGCCTGGTGAATCC 3 ′; реверс: 5, GGAAAGGCGGTGACACTAAT 3 ′). Праймери для GAPDH були такими: вперед = 5 ′ GAAGGGCTCATGACCACAGT 3 ′; реверс = 5 ′ GGATGCAGGGATGATGTTCT 3 ′. ПЛР дала унікальні смуги передбачуваних розмірів. Послідовність цих клонованих продуктів підтвердила генну специфічність. Спостерігалось майже логарифмічно-лінійне посилення, причому посилення відбувалося між циклами 26 і 32. Кожен зразок і реакція повторювались 3 рази. Експресія нормалізувалась до GAPDH як ендогенного еталону та щодо експресії гена базальної солі як калібратора.

Західний аналіз

Імуноблот-аналіз гомогенатів нирок проводили, як описано раніше. 12 мембран імунопробовували мишачим поліклональним антигуманним антитілом APN (CD13 Ab-3 Laboratory Vision). Вторинним антитілом було кон'юговане антитіло до IgG HRG кози (Santa Cruz Biotechnology). Плямки контролювали на відмінності в завантаженні зразків шляхом нормалізації на актин.