Діяльність ERK печінки відіграє певну роль в енергетичному обміні

Пінг Цзяо

1 Центр діабету та ендокринології Халлет, лікарня Род-Айленда, медична школа Уоррена Альперта, Університет Брауна, Провіденс, RI 02903, США

2 Школа фармацевтичних наук, Університет Цзілінь, Чанчунь, провінція Цзілінь, Китай

Бен Фен

Юцзе Лі

Цинь Хе

Хайян Сю

Анотація

1. Вступ

2. Матеріали та методи

2.1. Реактиви та клітини

Антитіла до фосфо-ERK, tERK та MEK1 були придбані у Cell signaling (Danvers, MA). Антитіло до тубуліну придбано у Abcam (Кембридж, Массачусетс). Антитіло до MKP-3 було придбано у компанії Santa Cruz Technology (Санта-Крус, Каліфорнія). Клітини Фао були надані д-ром Жиданом Ву (Інститут біомедичних досліджень Novartis) і культивовані в RPMI 1640 з 10% фетальною бичачою сироваткою (Xu et al., 2005).

2.2. Екстракція РНК та ПЛР-аналіз у реальному часі

Зразки РНК витягували з тканин за допомогою реагенту TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA) відповідно до інструкцій виробника. Зразки РНК, оброблені ДНКазою I, реверсували зворотну транскриптазу SuperScript III (Applied Biosystems, Карлсбад, Каліфорнія) та випадкові гексамери (Invitrogen) для отримання кДНК. ПЛР-аналіз у реальному часі проводили за допомогою реагенту Power SYBR Green RT-PCR (Applied Biosystems) на моделі термоциклера ABI Prism StepOnePlus (Applied Biosystems). Кожна 15 мкл реакції ПЛР містила 1 × реакційну суміш, 5,5 мМ MgSO4, 300 нМ прямого праймера та 300 нМ зворотного праймера. Програма термічного циклічного руху становила 50 ° C протягом 2 хвилин, потім 95 ° C протягом 10 хвилин протягом 1 циклу, потім 95 ° C протягом 15 секунд, після чого 60 ° C протягом 1 хвилини протягом 40 циклів. Аналіз кривої плавлення проводили для забезпечення специфічності праймерів. 28S рРНК використовували як еталонний ген у кожній реакції. Послідовності праймерів ПЛР в реальному часі є такими:

PEPCK 5 ’CTGCATAACGGTCTGGACTTC, 3’ CAGCAACTGCCCGTACTCC

G6Pase 5 ’CGACTCGCTATCTCCAAGTGA, 3’ GTTGAACCAGTCTCCGACCA

MKP-3, 5 ’ATAGATACGCTCAGACCCGTG, 3’ ATCAGCAGAAGCCGTTCGTT

FAS, 5 ’GGCTCTATGGATTACCCAAGC, 3’ CCAGTGTTCGTTCCTCGGA

ACC1, 5 ’CGGACCTTTGAAGATTTTGTGAGG, 3’ GCTTTATTCTGCTGGGTGAACTCTC

ACC2, 5 ’GGAAGCAGGCACACATCAAGA, 3’ CGGGAGGAGTTCTGGAAGGA

PPARα 5 ’AGAGCCCCATCTGTCCTCTC, 3’ ACTGGTAGTCTGCAAAACCAAA

CPT-1β 5 ’GCACACCAGGCAGTAGCTTT, 3’ CAGGAGTTGATTCCAGACAGGTA

VLCAD 5 ’TCAGGTGTTCCCATACCCATC, 3’ AAGGCGTCGTTCTTGGCAG

2.3. Вестерн-блот-аналіз

Тканини та клітини гомогенізували та лізували з холодним буфером для лізису, доповненим інгібіторами протеази. Білкові лізати відокремлювали на 4–12% гелі Bis-Tris-PAGE, переносили на мембрани полівінілідендифториду з подальшим блокуванням протягом 60 хвилин у 1% бичачому сироватковому альбуміні/1 × солі, забуференному Tris, з Твін-20 (TBST) або 5% знежирене сухе молоко/1 × TBST. Потім мембрани інкубували з відповідними первинними антитілами у присутності 1% бичачого сироваткового альбуміну/1 × TBST або 5% нежирного сухого молока/1 × TBST протягом ночі на коромислі при 4 ° C. Після ретельного промивання в 1 × TBST мембрани піддавали дії відповідних вторинних антитіл до пероксидази хрону в 5% нежирному сухому молоці/1 × TBST протягом 1 години при кімнатній температурі. Після ретельного промивання в 1 × TBST сигнали виявляли за допомогою розчину для виявлення хемілюмінесцентного вестерн-блоттингу (PerkinElmer, Waltham, MA) на системі візуалізації Alpha-Inotech fluorochem.

2.4. Побудова та очищення аденовірусу

2.5. Технічне обслуговування та аналіз мишей

2.6. Тести на толерантність до глюкози та інсуліну

Для тесту на толерантність до глюкози (GTT) мишей голодували протягом ночі, а потім вводили глюкозу в дозі 2 г/кг для мишей-самців, що годували чау, або в дозі 0,75 г/кг для мишей DIO. Рівні глюкози в крові вимірювали через 0, 15, 30, 45, 60 та 90 хвилин після ін'єкції. Для тесту на толерантність до інсуліну (ITT) мишей голодували протягом 6 годин і вводили інсулін у дозі 0,5U/kg для мишей-самців, що годували чау, та 1,5U/kg для мишей DIO. Рівні глюкози в крові вимірювали кожні 15 хвилин до 90 хвилин після ін'єкції.

2.7. Непряма калориметрія

Споживання кисню (VO2), вироблення діоксиду вуглецю (VCO2) та споживання їжі вимірювали індивідуально протягом 24 годин за допомогою комплексної лабораторної системи моніторингу тварин (Columbus Instruments, Columbus, OH) після одноденної аклімації. Під час експерименту миші мали вільний доступ до їжі та води. Витрати енергії розраховували за такою формулою: VO2 × (3,815 + 1,232 × RQ), нормували по відношенню до маси тіла тварини та коригували відповідно до ефективного значення маси, яке становить масу тіла 0,75 .