Домен гомології ліпріну є важливим для гомомерної взаємодії білка SYD-2Liprin-α у
Анотація
Вступ
Хімічні синапси складаються з пресинаптичного терміналу, синаптичної щілини та постсинаптичної спеціалізації. Активна пресинаптична зона, через яку вивільняються нейромедіатори, накопичує певний набір білків (Zhai and Bellen, 2004). Під час пресинаптичної диференціації ці білки доставляються шляхом транспортування на основі пухирців і збираються на зароджуваних синаптичних ділянках, утворюючи організовану наноструктуру (Jin and Garner, 2008). Молекулярні механізми того, як ініціюється та регулюється складання пресинаптичних компонентів, залишаються невідомими.
Білки сімейства Liprin-α є білками, що обробляють (Spangler and Hoogenraad, 2007). N-кінцеві половинки білків багаті спіраллю, і містять два висококонсервативні сегменти, які називаються "Ліпрін-α Гомологічні області 1 (LH1) і 2 (LH2)" (Schoch et al., 2002). Половини С-кінця містять три збережені домени стерильного α-мотиву (SAM), які часто називають LHD (для домену гомології Liprin), які пов'язують білок рецептора типу LAR тирозин фосфатазу (Serra-Pagès et al., 1998). N-термінал Liprin-α може пов'язувати кілька білків, включаючи RIM (Schoch et al., 2002) та ELKS/ERC/CAST (Ko et al., 2003), які відіграють певну роль у вивільненні пресинаптичних пухирців. Функції in vivo Liprin-α в синапсах найкраще вивчені у безхребетних. Caenorhabditis elegans SYD-2 і Drosophila Liprin-α локалізовані в центрі пресинаптичних активних зон і необхідні для організації активної зони в різних типах нейронів (Zhen and Jin, 1999; Kaufmann et al., 2002; Yeh et al., 2005; Fouquet et al., 2009; Stigloher et al., 2011).
У C. elegans, специфічні для гермафродиту рухові нейрони (HSN), SYD-2/Liprin-α та білок RhoGAP SYD-1 є важливими для складання нижніх пресинаптичних компонентів. Активність SYD-2 частково залежить від ELKS-1 та нового негативного регулятора RSY-1 (Dai et al., 2006; Patel et al., 2006; Patel and Shen, 2009). Раніше ми повідомляли, що місенс-мутація, syd-2 (ju487gf), змінює Arg184 на Cys в домені LH1 і викликає ефект посилення функції таким чином, що мутантний білок може сприяти складанню синаптичних компонентів навіть за відсутності SYD-1 (Dai та ін., 2006). Надмірна експресія SYD-2 може також обійти вимогу SYD-1 (Dai et al., 2006; Patel et al., 2006). Ці спостереження показують, що активність SYD-2 є критичною для правильного пресинаптичного складання. Раніше повідомлялося про гомомерні взаємодії SYD-2/Liprin-α (Serra-Pagès et al., 1998; Wagner et al., 2009; Astigarraga et al., 2010). Однак залишається недостатньо зрозумілим, чи важлива гомомерна взаємодія для їх функції та як вона опосередковується.
Тут ми провели трансгенні та біохімічні дослідження для вирішення ролі збереженого домену LH1 SYD-2. Наші дані підтримують пропозицію, згідно з якою властивість самозбірки SYD-2/Liprin-α, опосередковане димеризацією домену LH1, сприяє вищому порядку олігомеризації та кластеризації, що є важливим для пресинаптичного формування.
Матеріали і методи
Плазмідна конструкція.
Експресійні плазміди генерували за стандартними методами або з використанням системи клонування Gateway (Invitrogen). Промотори Prgef-1 та Punc-86 використовувались для вираження паннейронів та HSN відповідно. Мутантні конструкції SYD-2 або людського Liprin-α1A виготовляли методом ПЛР з використанням кДНК як шаблонів (Serra-Pagès et al., 1998; Zhen and Jin, 1999) та перевіряли шляхом секвенування. Для генерування SYD-2-DI використовували оліго нуклеотиди для пептиду GCN-IL (RMKQLEDKIEELLSKIYHLENEIARLKKLIGER) з розпірними елементами (GGSGG). КДНК GIT-1 (Source BioScience) клонували в pPD49.26 з YFP як С-кінцеву мітку, керовану промотором Punc-86. Детальна інформація для плазмід доступна за запитом.