Довголанцюгові аналоги жирної кислоти пригнічують пухлинний процес молочної залози та розвиток раку

Анотація

Вступ

Кетогенні дієти з обмеженим вмістом вуглеводів, збагачені жиром за рахунок вуглеводів, неодноразово повідомляли про придушення раку молочної залози (15, 16). Придушення пухлини кетогенними дієтами приписується обмеженню інсуліну та IGF1, що діють як фактори росту (розглянуто в посиланні 17), та обов’язковій вимозі злоякісних клітин до метаболітів, похідних глюкози (наприклад, нуклеотидів, NADPH), для забезпечення їх потреб у біомасі. (Ефект Варбурга, огляд у посиланні 18). Дійсно, рак молочної залози сприяє інсулінорезистентності/гіперінсулінемії, а сенсибілізатори інсуліну, що використовуються для лікування діабету 2 типу (наприклад, метформіну), виявляються ефективними для придушення пухлинного генезу загалом та раку молочної залози зокрема (19). В якості альтернативи, ефективність кетогенних дієт у придушенні пухлинного генезу може бути надалі властивою ефективності вільних/нестерифікованих довголанцюгових жирних кислот (LCFA), якщо дозволено досягти досить високих внутрішньоклітинних концентрацій. Обмеження вуглеводів дійсно може це дозволити, обмежуючи доступність гліцерин-3-фосфату та інсуліну, необхідних для етерифікації LCFA у ліпідні продукти (20).

аналоги

Передбачувана притаманна ефективність нестерифікованого LCFA для придушення трансформації може бути змодельована аналогами MEDICA. Аналоги MEDICA (21) складаються з довголанцюгових, α, ω – діолових кислот [HOOC – C (α ′) - C (β ′) - Q – C (β) –C (α) –COOH, де Q являє собою довголанцюговий серцевинний елемент], заміщений в αα ′ (Mαα), ββ ′ (Mββ) та/або інших необов’язкових вуглецевих вуглецях. Аналоги MEDICA можуть бути тіоестерифіковані до відповідних CoA-тіоефірів, але вони не естерифікуються в ліпіди і не перетворюються в кераміди, тоді як заміни в положеннях αα або ββ ′ блокують їх β-окислення. Аналоги MEDICA переважно виводяться з жовчю у вигляді відповідних глюкуронідів. Таким чином, аналоги MEDICA можуть імітувати аллостеричну активність вільних/нестерифікованих LCFA, уникаючи при цьому їх ролі як субстратів для β-окислення або етерифікації в ліпіди. Більше того, аналоги MEDICA довели протидіабетичну гіполіпідемічну ефективність у серії моделей тварин із діабетом із ожирінням (22–24, 26), що викликало наш інтерес до вивчення ефективності кетогенної дієти та MEDICA в контексті раку молочної залози.

Матеріали і методи

Тварини та дієти

Імуногістохімія

Зразки пухлини молочної залози, закріплені у 4% забуференному формальдегіді, були вбудовані в парафін. Зрізи (5 мкм) депарафінізовували та регідратували за допомогою градуйованих розведень етанолу з подальшим варінням у 25 ммоль/л цитратного буфера, рН 7,4, при 115 ° C протягом 3 хвилин. Ендогенну пероксидазну активність блокували 3% перекисом водню. Потім зрізи інкубували з первинними антитілами, як зазначено, з подальшою інкубацією з пероксидазою хрону (HRP) або кон'югованими флуоресцентними вторинними антитілами (лабораторія Джексона). Зрізи, інкубовані HRP, були забарвлені гематоксиліном. Інтенсивність флуоресценції аналізували за допомогою конфокальної мікроскопії з використанням DAPI для візуалізації ядер (Zeiss LSM 710; Axio спостерігач Z1). Легкі вирізали і зафіксували у формаліні протягом ночі, а потім вклали парафін. Зрізи (5 мкм) фарбували гематоксиліном та еозином (H&E) та аналізували за допомогою комп’ютерної мікроскопії (Ariol SL-50; Olympus BX61 Applied Imaging).

Клітинні культури

Первинні клітини MMTV-PyMT були виділені від 16-тижневих мишей MMTV-PyMT, як описано раніше (25). Клітини Met-1 (доктор Олександр Боровський, Центр порівняльної медицини, Каліфорнійський університет, Девіс, Девіс, Каліфорнія) та первинні клітини культивували в повному DMEM (Biological Industries), доповненому розчином пеніцилін-стрептоміцину, l -глютаміном та 10 % FCS з подальшим додаванням MEDICA, як зазначено. Кількісну проліферацію визначали за допомогою аналізу метиленового синього. Клітини Met-1, культивовані на 24 планшеті, трансфікували репортерною плазмідою M67-TATA-TK-LUC (1 мкг), експресійними плазмідами для конститутивного STAT3 (0,1 мкг) та для CMV – β-галактозидази (0,1 мкг), використовуючи jetPEI DNA трансфекційний реагент (26). Через 8 годин середовище змінювали і клітини обробляли протягом 24 годин за допомогою MEDICA, як зазначено. Активність люциферази, нормалізовану до β-галактозидази, вимірювали, як описано раніше (26). Клітини HCC1954 (ATCC CRL-2338) культивували в RPMI-1640 (Biological Industries), доповнену розчином пеніциліну-стрептоміцину та 10% FCS, і додавали MEDICA, як зазначено. Там, де вказано, клітини HCC1954 інфікували лентівірусними нокаут-конструкціями sh-c-Src, sh-STAT3 або плазмідами, що скремблюють (Sigma Mission), з подальшим відбором пуроміцину.

Клоногенний аналіз

Клітини відповідних експериментальних пластинок трипсинізували. Загалом 7500 клітин висівали на 60-мм пластину і давали змогу формувати колонії протягом 10 днів. Клітини фіксували 0,625% глютеральдегідом і фарбували метиленовим синім. Були підраховані колонії розміром понад 400 мкм.

Лізис клітин та вестерн-блот

Культивовані клітини зішкребали 1X буфером для лізису (50 ммоль/л Tris HCl рН 8,0, 1% Triton X-100, 1 ммоль/л EGTA, 1 ммоль/л EDTA, 150 ммоль/л NaCl, 5 ммоль/л NaPPi, 50 ммоль/л NaF, 1 ммоль/л PMSF, 1 ммоль/л Na ванадат, 40 нмоль/л bpVfan і коктейль інгібітора протеази (Sigma), і центрифугували протягом 15 хвилин при 12500 об/хв. Заморожені зразки пухлини гомогенізували в лізисному буфері з використанням Polytron Концентрацію білка визначали за допомогою BCA (Thermo Scientific). Якщо не вказано інше, білкові лізати готували в буфері зразків SDS [62 ммоль/л Трис (рН 6,8), 2,3% SDS, 0,64 ммоль/л меркаптоетанолу, 10% гліцерину], піддані SDS-PAGE, електротрансферовані на нітратні мембрани целюлози (Schleicher & Schuell) і зондовані зазначеним першим антитілом, а потім міченим HRP другим антитілом. Там, де зазначено, білкові лізати готували в буфері зразків SDS, у якому відсутній меркаптоетанол. за допомогою ECL, а інтенсивність окремих смуг визначали за допомогою денситометрії Програмне забезпечення TINA 2.10.

Імунопреципітація

Клітини MET-1 інкубували, як зазначено. Після інкубації клітини один раз промивали в холодному PBS і лізували 50 ммоль/л Hepes (рН 7,4), 150 ммоль/л NaCl, 10% гліцерину, 1,5 ммоль/л MgCl2, 1 ммоль/л EGTA, 1% тритону, 50 ммоль/л β-гліцеролфосфату, 25 ммоль/л NaF, 1 ммоль/л Na-ванадату, 40 нмоль/л bpVphen, суміш інгібіторів протеази (Sigma) та 17,5 мг/мл октилу бета-D-глюкопіранозиду (Sigma). Лізати витримували на льоду протягом 30 хвилин і центрифугували при 12000 об/хв протягом 15 хвилин. Лізат 250 мкг інкубували протягом 4 годин з білком A/G гранулами (Santa Cruz Biotechnology), попередньо завантаженим зазначеним антитілом. Імунопреципітат промивали три рази промивним буфером [20 ммоль/л Hepes (рН 7,4), 150 ммоль/л NaCl, 0,1% Tx-100, 10% гліцерину], суспендували в буфері зразків SDS і кип'ятили протягом 8 хвилин. Імунопреципітовані білки аналізували за допомогою SDS-PAGE/Вестерн-блот.