Дуоденальний лептин стимулює діабет, що секретує холецистокінін

Свідчення позитивної петлі зворотного зв'язку лептину-холецистокініну

  1. Сандра Гійо,
  2. Маріон Буйс,
  3. Аннік Цокас,
  4. Жан П'єр Леньо і
  5. Андре Бадо
  1. Від Національного інституту сантету та дослідницького медікалу (INSERM) Unité 410, Факультет медицини Ксав'є Біша, Париж, Франція
  1. Зверніться до листування та запитів на передрук до Андре Бадо, INSERM Unité 410, Faculté de Médecine Xavier Bichat, 16, rue Henri Huchard, 75018 Париж, Франція. Електронна пошта: badobichat.inserm.fr .

Свідчення позитивної петлі зворотного зв'язку лептину-холецистокініну

Анотація

  • CCK, холецистокінін
  • ERK, кіноза, пов’язана з позаклітинним сигналом
  • ERK-P, фосфо-ERK
  • INSERM, Національний інститут Сантезу та науково-дослідної медицини
  • ІЧ, імунореактивний
  • MAPK, мітоген-активована протеїнкіназа
  • MEK, MAPK кіназа
  • PI3-K, фосфоїнозитид 3-кіназа
  • RIA, радіоімуноаналіз
  • СТАТ, перетворювачі сигналів та активатори транскрипції.

Спочатку повідомлялося, що лептин, продукт гена ob, виробляється жировими клітинами (1). Він виділяється в кров і транспортується через гематоенцефалічний бар’єр у гіпоталамус, де активує специфічні рецептори лептину (2,3) та регулює енергетичний гомеостаз, змінюючи споживання та витрачання енергії (4–6). Лептин регулює споживання їжі за допомогою механізмів, що включають перехресні розмови між рецепторами лептину гіпоталамусу та різними нейропептидами, що беруть участь у контролі годування. Рецептор лептину (Ob-R) є членом сімейства gp130 цитокінових рецепторів. Це відбувається в декількох ізоформах, що є результатом альтернативного сплайсингу гена рецептора db лептину (2,3). В даний час вважається, що довга ізоформа, Ob-Rb, може активувати перетворювачі сигналу та активатори шляхів транскрипції (STAT), тоді як і Ob-Rb, і коротка ізоформа (Ob-Ra) можуть перетворювати сигнали через субстрати рецепторів інсуліну та через шляхи мітоген-активованої протеїнкінази (MAPK) (7).

стимулює

Сигнали, що виникають із верхніх відділів шлунково-кишкового тракту при годуванні, передаються в мозок блукаючим нервом. Ці сигнали є ключовими компонентами контролю насичення, спричиненого їжею. Холецистокінін (CCK) секретується з ендокринних I клітин дванадцятипалої кишки і зазвичай функціонує як один із цих короткочасних сигналів ситості (8,9). Цікаво, що спричинене лептином пригнічення прийому їжі (10) та стимуляція екзокринних секрецій підшлункової залози (11) можуть блокуватися антагоністом рецептора CCK-1. Ці дані дозволяють припустити, що ендогенний CCK бере участь у цих ефектах, діючи через рецептори CCK-1. Однак наразі невідомо, чи лептин безпосередньо модулює вивільнення CCK.

Лептин також виробляється шлунком (12–14) і в основному виділяється в шлунковий сік після CCK у щурів (12,15) та після стимуляції секретину або вагуса у людей (14,16). Частина шлункового лептину не повністю руйнується внаслідок протеолізу, що вказує на те, що він потрапляє в кишечник в активній формі і, отже, може ініціювати біологічні процеси, що контролюють функції кишкового тракту. Справді, просвітній лептин підвищує активність протоннозалежного транспортера, що межує з кистю, PepT1, що посилює кишкову абсорбцію олігопептидів (17). Це підвищує ймовірність того, що лептин також може модулювати секреторну активність ендокринних клітин кишечника за умови, що лептин присутній у кишковому соку.

У цьому дослідженні ми вивчали ефекти in vitro рекомбінантного лептину на вивільнення CCK та досліджували внутрішньоклітинні механізми дії лептину в клітинах STC-1, що секретують CCK. Ми припустили, що лептин, який досягає дванадцятипалої кишки, здатний модулювати вивільнення CCK. Для перевірки цієї гіпотези ми визначили, чи присутній лептин у дуоденальному соку, а потім дослідили ефект in vivo прямої дуоденальної доставки лептину на концентрацію CCK у плазмі крові на моделі, що перфузує дванадцятипалу кишку. Ми поставили під сумнів фізіологічну значимість даних, проаналізувавши in vivo кінетичні закономірності концентрації CCK та інсуліну в плазмі крові та аналізуючи вміст лептину в шлунку після прийому їжі у щурів Цукера. Нарешті, ми дослідили ефекти in vivo антагоністів рецепторів CCK на зміни цих параметрів, спричинені годуванням.

ДИЗАЙН ДИЗАЙН І МЕТОДИ

Культура клітин.

Клітини STC-1 (подарунок від д-ра Дж. Абелло, Національного інституту імені Сантету та університету досліджень медицини [INSERM] U-45, Ліон, Франція) походять від клітинних ліній ендокринної пухлини кишки, розроблених на мишах, що експресують трансген для промотору інсуліну щурів, зв’язаного з вірусом мавпи 40 великим антигеном Т та антигеном малого t вірусу поліоми (18). Клітини STC-1 між пасажами 15 і 35 вирощували в RPMI-1640 плюс глутамін (Sigma, St Louis, MO), доповнений 5% фетальною бичачою сироваткою, 100 одиниць/мл пеніциліну та 100 мкг/мл стрептоміцину (Life Technologies, Гранд-Айленд, Нью-Йорк) у зволоженій атмосфері, що містить 95% O2 та 5% CO2 при 37 ° C.

RT-PCR аналіз рецепторів лептину.

Загальну РНК екстрагували з клітин STC-1 реагентом Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA). Коротко кажучи, кДНК першої нитки синтезували із загальної РНК 2 мкг і реверсували транскрипцію за допомогою 200 одиниць зворотної транскриптази за допомогою набору Superscript II (Invitrogen) відповідно до рекомендацій виробника. Наступні олігонуклеотидні праймери були синтезовані Sigma Genosys (Кембриджшир, Великобританія): прямий праймер для Ob-Rb був 5′-ATGAAGTGGCTTAGAATCCCTTCG-3 ′, а зворотний праймер 5′-ATATCACTGATTCTGCATCCTG-3 ′. Праймери, що використовувались для гена β-актину, були наступними: 5′-CGAGAAGATGACCCAGATCATG-3 ′ і зворотний 5′-AGTGATCTCCTTCTGCATCCTG-3 ′. Зразки денатурували нагріванням при 95 ° С протягом 3 хв. Потім ПЛР проводили в умовах, описаних раніше (14). Продукти ПЛР відокремлювали електрофорезом у 2% агарозному гелі. Гель фарбували бромідом етидію і розглядали під ультрафіолетовим освітленням. Очікувані розміри продуктів ПЛР становили 375 п.н. для Ob-Rb та 606 п.н. для β-актину.

Вестерн-блот-аналіз.

Для загальної екстракції білка гранули клітин STC-1 гомогенізували при 4 ° C у буфері для лізису, доповненому 0,1 мг/мл фенілметилсульфонілфториду, 100 мкмоль/л апротиніну та 100 ммоль/л NaVO4. Гомогенати центрифугували при 15000g протягом 30 хв при 4 ° C, і супернатанти збирали для вестерн-блот-аналізу. Кількісну концентрацію білка визначали за допомогою аналізу білка Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Геркулес, Каліфорнія).

Коротко, солюбілізовані білки розщеплювались електрофорезом на 7,5% гелях SDS-PAGE. Розділені білки переносили на нітроцелюлозні мембрани та піддавали імуноблот-аналізу за допомогою поліклональної анти-сироватки Ob-Rb, вирощеної у кроликів, проти СООН-кінцевого пептиду рецептора лептину (амінокислоти 890–903), специфічного для ізоформи Ob-Rb (OBR 12 -A; Biotrend Chemikalien, Кельн, Німеччина), розведений 1: 750. Після 1-годинної інкубації мембран з кон'югованим антитілом, пероксидазою пероксидази хрону (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), розведеним 1: 1000, імунні комплекси виявляли посиленою хемілюмінесценцією (Pierce, Rockford, IL).

Імуноцитохімія.

Клітини STC-1 висівали на 4-лункові скляні предметні стекла Lab-Tek II (Nalge Nunc International, Naperville, IL). Через 2 дні інкубації при 37 ° C з 95% O2: 5% CO2 середовище видаляли і клітини двічі промивали холодним PBS. Потім ми додали фіксатор формаліну (4% параформальдегіду) та інкубували клітини протягом 10 хв. Потім клітини перетравлювали 0,1% пепсину в 0,01 н. HCl, рН 2,25, протягом 10 хв для отримання антигену. Перед імунореакцією активність ендогенної пероксидази видаляли додаванням 0,3% H2O2 та інкубацією протягом 5 хв. Клітини інкубували протягом ночі при 4 ° C з кролячою поліклональною анти-сироваткою Ob-Rb (OBR 12-A) або поліклональною анти-сироваткою Ob-R (TP283), вирощеною у кроликів проти NH2-кінцевого пептиду рецептора лептину (амінокислоти 25–208 ) (Clinisciences, Монруж, Франція) або з кролячим антитілом до CCK8 (Sigma), кожне з яких розбавляли 1: 100. Потім предметні склянки інкубували 1 годину при кімнатній температурі з антитілом до кролика до свині, а потім із кролячим пероксидазно-антипероксидазним комплексом Z0113 (Dako, Carpinteria, CA), кожен розведений 1: 100. Імуногістохімічне фарбування проводили з використанням 3 ′, 3′-діамінобензидину гідрохлориду в якості пероксидазного хромогену (Sigma).