Ефективність екстракту листя кінського каштана ALH-L1005 як матричного інгібітора металопротеїнази у

Се Юн Кім

1 кафедра ветеринарної хірургії, Коледж ветеринарної медицини, Сеульський національний університет, Сеул 08826, Корея.

Тае Хён Кім

Парк Шін Ае

Виграв Тае Кім

Молодий Ву Парк

Дже Санг Ан

Манбок Чонг

Мін-Янг Кім

2 AngioLab, Inc. Теджон 34016, Корея.

Kangmoon Seo

Анотація

Вступ

Захворювання пародонту зумовлені бактеріальною колонізацією пародонта (бляшками) та стимуляцією імунних реакцій господаря через побічні бактеріальні продукти [1]. Кілька дослідників продемонстрували, що фармакологічна модуляція перебільшених запальних та імунних реакцій господаря на додаток до елімінації мікробів є корисною при лікуванні пародонтозу [9,23]. Повідомлялося, що матричні металопротеїнази (ММП) відіграють важливу роль у протеолізі компонентів позаклітинного матриксу [4]. Під час прогресування захворювання пародонту протеолітичні ферменти господаря та похідні з мікробів опосередковують деструкцію позаклітинного матриксу [23]. Недавні дослідження показали, що MMP-2 (желатиназа A) та MMP-9 (желатиназа B) можуть спричинити руйнування тканин пародонту; крім того, повідомляється, що основні протеїнази, що беруть участь у руйнуванні та реконструкції тканин пародонта [5,11,18], були отримані поліморфноядерні лейкоцити (ПМН) (MMP-8, MMP-9). Інші дослідження показали, що зразки кревікулярної рідини ясен від пародонтозу містять MMP-13, якого не було виявлено у зразках здорової ясен [10]. Таким чином, інгібування ММП, що походять від господаря, може мати ключову роль у профілактиці та зменшенні прогресування пародонтозу.

У народній медицині продукти кінського каштана (Aesculus hippocastanum L.) та їх екстракти використовувались як ліки від кашлю, застійних явищ, артриту та ревматизму. Зокрема, екстракт насіння кінського каштана містить есцин, кислотний тритерпеновий глікозид, який має протизапальну, протинабрякову, антисекреторну та загальнозміцнюючу дію [19]. Екстракти насіння кінського каштана комерційно доступні у всьому світі для лікування хронічної венозної недостатності. Екстракти листя кінського каштана містять лише сліди есцину, але багаті флавоноїдами, включаючи кверцетин і кемпферол, а також глікозидами флавонолу, такими як кверцитрин. Такі екстракти комерційно доступні для ін’єкцій і використовуються для лікування набряків та венозної недостатності [2].

Метою цього дослідження була оцінка клінічного ефекту екстракту листя кінського каштана ALH-L1005 як інгібітора MMP на прогресування пародонтиту у собак бігль з експериментально індукованим пародонтитом.

Матеріали і методи

Протокол цього дослідження був схвалений Інституційним комітетом з догляду та використання тварин (SNU-080118-2; Сеульський національний університет, Корея). Всі експериментальні операції та обстеження проводились під загальним наркозом з комерційною комбінацією золазепаму та пілетаміну (5 мг/кг, внутрішньом’язово [ІМ]; Вірбак, Франція).

Хімічний препарат

Лист кінського каштана (Aesculus hippocastanum L; артикул № 38135000) був придбаний у Kräuter Mix (Німеччина), а екстракт ALH-L1005 приготований наступним чином: Десять кілограмів висушеного листя кінського каштана екстрагували 200 л 25% водного етанолу на 2 ч і фільтрується. Фільтрати концентрували під вакуумом і сушили з отриманням 1,73 кг ALH-L1005. Отриманий ALH-L1005 стандартизували з еталонним з'єднанням за допомогою високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ). Для перорального прийому сформували капсули екстракту 150 мг ALH-L1005.

Аналіз MMP на ALH-L1005

Для встановлення найбільш ефективної формули експериментально оцінювали інгібуючу активність ММП доксициклін, комерційний екстракт насіння (Фінцельберг, Німеччина), комерційний екстракт листя (доктор Вілмар Швабе, Німеччина) та ALH-L1005. Перед аналізом MMP рекомбінантні людські MMP-2 та MMP-9 (R&D Systems, США) активували за допомогою 1 мМ APMA. Активність MMP вимірювали на спектрофлуорометрі (Perkin-Elmer, USA) з використанням 2,4-динітрофеніл-Pro-Leu-Gly-Met-Trp-Ser-Arg (Calbiochem, США) як субстрату. ММР (10 нМ) і субстрат (1 мкМ) змішували в 2 мл реакційного буфера (50 мМ трицину, рН 7,5, 10 мМ CaCl2, 200 мМ NaCl) разом з кожним досліджуваним матеріалом. Інтенсивність флуоресценції вимірювали при кімнатній температурі з використанням довжини хвилі збудження 280 нм та довжини хвилі випромінювання 360 нм.

Препарат для здорової ясен

Для дослідження було використано шістнадцять, приблизно 1,5-річних собак-біглів. Всі зуби кожного бігля були масштабовані та відполіровані. У наступні 2-тижневий період чищення зубів проводили двічі на день без анестезії для отримання оптимального статусу пародонту. Протягом цих 2 тижнів біглів годували твердою дієтою пелетного типу, щоб підтримувати здоров'я ясен за рахунок зменшення потенціалу утворення нальоту [20].

Експериментально індукований пародонтит

Після підготовки здорової ясен експериментальний пародонтит був індукований наступним чином: Шви з використанням 2-0 шовку (Ейлі, Корея) з допомогою зубного лігатурного дроту (ClassOne Orthontics, США) зав'язували навколо шийки матки правої верхньої частини PM2, PM3 та PM4, а праворуч нижні зуби PM3, PM4 та M1. Чищення зубів припиняли після перев'язки і давали м'яку зволожену їжу протягом 8 тижнів. Зуби, відкріплені протягом 8 тижнів, були виключені з дослідження. Лігатури видаляли після періоду індукції пародонтиту, і собак випадковим чином розподіляли на 4 групи: негативний контроль (NC; лише допоміжна речовина), позитивний контроль (ПК; доксициклін; DongKoo Bio & Pharma, Корея), ALH-L1005 низька доза тест (LT) та тест ALH-L1005 у високих дозах (HT) (таблиця 1). Всі ліки вводили перорально, двічі на день, наступні 6 тижнів. Після видалення лігатури досліджували показники стану пародонта, включаючи індекс нальоту (PI), індекс ясен (GI), глибину пародонтальної кишені (PPD), рівень клінічної прив’язаності (CAL) та кровотечу при тиску (BoP). Стандарти були модифіковані, як узагальнено в Таблиці 2 [17,26,31]. Всі вимірювання проводив один досвідчений клініцист (SE Kim) із використанням стерильного кольорового пародонтального зонда (Helmut Zepf Medizintechnik, Німеччина).