Ендотелій артерій створює дозвільну нішу для розширення кровотворної крові пуповинної крові людини
Анотація
Передумови
Незважаючи на те, що пуповинна кров (CB) пропонує обіцянку для лікування пацієнтів із гемологічними злоякісними новоутвореннями та імунними розладами високого ризику, обмежена кількість гемопоетичних стовбурових клітин (HSC)/клітин-попередників в одиниці CB та важкі обставини при розширенні ex vivo роблять це досить складним завданням розробити успішну клітинну терапію.
Методи
У цьому дослідженні було розроблено нову стратегію підтримки ex vivo розширення гемопоетичних стовбурових і клітин-попередників (HSPC) шляхом кокультури з інженерними ендотеліальними клітинами артерії пуповини людини (HuAECs-E4orf1-GFP), що виражає E4ORF1 стабільно за допомогою ретровірусної системи.
Результати
Кокультура клітин CD34 + hCB з HuAECs-E4orf1-GFP призвела до генерування значно більшої кількості загальних ядерних клітин CD34 + CD38 - та CD34 + CD38 - CD90 + HSPC порівняно з цитокінами окремо або в культурі з пуповинною веною людини ендотеліальні клітини (HuVEC) після 14-денної ампліфікації. Потенціал багатолінійної диференціації in vitro та здатність до повторного заселення in vivo розширених гемопоетичних клітин, культивованих HuAECs-E4orf1-GFP, також були помітно посилені порівняно з іншими двома контрольними групами. DLL4, головний детермінант ідентичності артеріальних ендотеліальних клітин (ЕК), асоціювався з клітинами CD34 + hCB, ампліфікованими на HuAECs-E4orf1-GFP.
Висновки
У сукупності ми продемонстрували, що HuAEC діяли як дозвільна ніша у сприянні розширенню HSPC. Наше дослідження також показало, що вирішальні фактори та пов'язані шляхи, представлені в HuAEC, можуть дати підказку щодо збереження самовідновлення добросовісних HSC.
Вступ
Гемопоетичні стовбурові клітини (HSC), що перебувають на вершині складної клітинної ієрархії крові, можуть поповнюватися шляхом самообновлення та давати початок усім іншим клітинам крові [1]. В даний час генерування HSC з плюрипотентних стовбурових клітин (PSC), включаючи індуковані плюрипотентні стовбурові клітини (iPSC) та ембріональні стовбурові клітини (ESC), ймовірно, недосяжне [2,3,4]. А кістковий мозок (КМ), пуповинна кров (МКБ) або мобілізована периферична кров (МПБ) є єдиним джерелом ГСК, доступних на даний момент [5,6,7]. Отже, встановлення системи ex vivo розширення HSC відкрило б унікальну можливість для вивчення самовідновлення HSC людини та забезпечило нове джерело терапевтичних клітин для розладів крові. Досягнення цієї мети вимагає детального розуміння найважливіших елементів, що сприяють посиленню та підтримці функцій HSC в гемопоетичній ніші in vivo.
Первинні АЕС мають обмежену здатність до розширення та зазнають дедиференціації в культурі [17, 18], що робить фізіологічне застосування складним для ніші гемопоезу. З цього приводу тут ми розробили стабільні лінії HuAEC, що володіють загальноприйнятими характеристиками АЕС шляхом трансдукції E4ORF1 та зелений флуоресцентний білок (GFP) з використанням ретровірусних векторів (HuAECs-E4orf1-GFP). Вони засновані на теорії E4orf1 як сигналу «за життя», що сприяє виживанню первинних ендотеліальних клітин (ПЕК) [19, 20]. Потім ми виявили, що HuAECs-E4orf1-GFP мають потенціал для створення дозвільної ніші для експансії клітин hCB CD34 +, як визначено загальновизначеним набором маркерів для гемопоетичних стовбурових та попередніх клітин людини (HSPC), аналізів колоній та in vivo потужність повторного заселення у мишей NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl/SzJ (NSG). Крім того, ми виявили, що сигнальні молекули Notch сприяють підтримуючому ефекту HuAECs-E4orf1-GFP. Наші дані вперше показують функціональний зв’язок між HuAEC та ампліфікацією HSC та вказують на потенційну роль артеріальної судинної ніші для декодування інформації in vivo для самовідновлення та розширення людських HSC.
Матеріали і методи
Виділення та посів артеріальних/венозних клітин пуповини
Підготовка та трансфекція вірусів
HuAECs-E4orf1-GFP та сконструйовані ендотеліальні клітини пуповинної вени людини [20] (HuVECs-E4orf1-GFP) були створені шляхом введення ретровірусного вектора у первинні HuAECs та HuVECs. Ретровірус генерувався шляхом трансфекції MSCV-N E4ORF1 (Адджен, Шанхай, Китай; види, аденовірус людини 5; розмір, 384 п.н. плюс 8162 п.н.; тип вектора, експресія ссавців, ретровірус; селективні маркери, пуроміцин) та pMX-GFP (надано доктором Хіроюкі Хіраї, США) у клітинах Plat A з використанням ліпофектаміну 2000 (Invitrogen, Карлсбад, Каліфорнія, США). Ретровірусні конструкції збирали через 44 та 68 год після трансфекції. E4ORF1-трансфіковані ЕК відбирали з 0,5 мкг/мл пуроміцину (InvivoGen, Шанхай, Китай). DLL4 shRNA та контрольна shRNA (обидві несуть мітку GFP) були розроблені Genechem (Шанхай, Китай) та трансфіковані індивідуально у первинні HuAEC. Трансфіковані клітини GFP + збагачували за допомогою флуоресцентно-активованого сортування клітин (FACS) потокового цитометра Verse (BD Biosciences, Franklin, NJ, USA). Експерименти з трансфекцією вірусу проводили на ДВК від трьох різних донорів.
Проточна цитометрія (FCM)
Проточний цитометричний аналіз проводили з використанням таких антитіл: CD144-PE, CD45-APC, CD133-PE, CD31-APC та CD309-PE для первинних HuAEC та HuVEC; FVS510, CD34-PE, CD38-APC та CD90-PE-cy7 для культивованих аналізів ex vivo; та CD45-APC проти людини, CD19-APC, CD11b-PerCP-CY5.5 та CD45.1-FITC проти миші для експериментів з трансплантації in vivo. Клітини фарбували при 4 ° С протягом 40 хв, захищаючи від світла. Відфільтровані (70 мкм) зразки аналізували на проточному цитометрі FACSVerse. Всі антитіла походять від BD Biosciences (Франклін, Нью-Джерсі, США) або eBioscience (Сан-Дієго, Каліфорнія, США).
Імунофлюоресценція
Первинні HuAEC та HuVECs фарбували для підтвердження ідентичності клітин. Культури фіксували у 4% параформальдегіді (Sigma-Aldrich, Шанхай, Китай), просочували та блокували, а потім інкубували протягом ночі в блокуючому розчині, що містить первинне антитіло проти фактора фон Віллебранда (vWF; 1: 500; Sino Biological, Пекін, Китай) . Кон'югований FITC козячий IgG (1: 200; Beijing Zhongshan Jinqiao Biological Technology, Пекін, Китай) використовувався як вторинне антитіло, а DAPI (1 мг/мл; Рош, Базель, Швейцарія) як протиядерний засіб. Візуалізацію проводили з використанням конфокальної мікроскопії (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) та Volocity Software (PerkinElmer, Waltham, MA, USA).
Аналіз формування труб
Виходячи з раніше описаних [23], первинні HuAECs та HuVECs, суспендовані в середовищі EGM-2 з добавкою VEGF (100 нг/мл; R&D Systems, Aimolivel, Каліфорнія, Каліфорнія, США), були засіяні в 6-лункові пластини, покриті Matrigel ( BD Biosciences, Franklin, NJ, USA) при щільності 10000 клітин/см 2. Через 24 години інкубації клітини фотографували за допомогою конфокальної мікроскопії та програмного забезпечення Volocity.
Кількісний аналіз ланцюгової реакції полімерази в реальному часі (qRT-PCR)
Загальну РНК екстрагували з клітин за допомогою RNeasy Micro Kit (QIAGEN, Нью-Йорк, Нью-Йорк, США) та зворотну транскрипцію, використовуючи ReverTra Ace qPCR RT Master Mix (TOYOBO, Шанхай, Китай) відповідно до технічних вимог виробника. Продукти ПЛР були виявлені за допомогою суміші THUNDERBIRD SYBR qPCR (TOYOBO, Шанхай, Китай). Послідовності праймерів, що використовуються в аналізах qRT-PCR, наведені в таблиці 1.