Фізіологічний та транскриптомний аналіз рису індика «MH86» з надмірним вираженням OsSPL14 bioRxiv

Анотація

Виділити Трансгенні рослини з надмірною експресією OsSPL14 показали коротший період росту, короткі вузькі листя прапора та густо-зелене листя. Профіль транскрипту, рівень абсцизової кислоти (ABA) і гіберелінової кислоти (GA3), а також склад слів також очевидно змінилися.

аналіз

Вступ

OsSPL14 є членом генів SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE (SPL). Гени SPL кодують рослинні специфічні фактори транскрипції, що містять висококонсервований домен-зв'язуючий домен ДНК, що містить іон цинку, відомий як SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN [SBP] -box (Yamasaki et al., 2004). SPB1 і SPB2 були оригінальними генами SPL, ідентифікованими у Antirrhinum majusas, які зв'язуються з промотором флористичного гена ідентичності гена SQUAMOSA (Klein et al., 1996).

Багато генів SPL містять цільову ділянку мікроРНК (мікроРНК), включаючи miR156/157, і цільові сайти знаходяться в кодуючих областях або 3 'нетранслируемой області (3' UTR). У Arabidopsis thaliana, 10 з 16 генів SPL, як передбачається, є мішенями miR156 (Rhoades et al., 2002; Schwab R et al., 2005). SPL3, SPL4 і SPL5 мають цільову ділянку для miR156 у своєму 3 ′ UTR і сильно репресуються miR156. Надмірна експресія SPL3 прискорила цвітіння, і рослини, що експресують SPL3, що містять мутований цільовий ділянку miR156 або без цільового місця miR156, з’явилися раніше цвітінням і менше листям (Cardon et al., 1997; Wu and Poethig, 2006; Gandikota et al., 2007). Крім того, паралогічні гени SPL9 і SPL15 з цільовим сайтом miR156, що беруть участь у контролі фазового переходу неповнолітнього у дорослу особину, і подвійні мутанти spl9 spl15 показали укорочений пластохрон, змінену архітектуру суцвіття та посилене розгалуження (Schwarz et al., 2008; Wang et al., 2008). Крім того, SPL8 без мішенних мішень РНК впливав на мегаспорогенез, утворення трихома на чашолистках та подовження ниток тичинок (Unte et al., 2003). Відповідно, серія досліджень гена SPL у Arabidopsis thaliana припустила, що гени AtSPL головним чином пов’язані з розвитком рослин та цвітінням.

У цьому дослідженні ми ввели OsSPL14 у сорт індика «MH86» і отримали трансгенні лінії, що надмірно експресують OsSPL14 з більш коротким періодом росту, коротким вузьким листям прапора, меншим числом румпель, сильним культуром. Аналіз транскриптома показав, що гени, що беруть участь у біосинтезі каротиноїдів та біосинтезі лігніну, регулюються в трансгенних рослинах. Рівні ABA та GA3 покращилися, а вміст кульлі лігніну, целюлози, кремнію та калію явно збільшився. У сукупності ці відкриття доповнюють опис функцій OsSPL14.

Матеріали і методи

Генерація трансгенного рису

Плазміда pCAMBIA1300-OsSPL14 (додаткова фіг. S1; OsSPL14/IPA1: GenBank GU136674.1, 7229 bp, що містить промотор та область кодування мРНК) була введена в зрілі зародки рису (сорт Oryza sativa L.indica 'MH86') за допомогою Agrobacterium -посередкована трансформація, як описано Даттою (1997). Трансформовані клітини відбирали спочатку на середовищі NB (Sivamani et al., 1996), що містить 50 мг/л гігроміцину (SIGMA-ALORICH). Після 3-4 циклів відбору з 14-денною тривалістю на цикл вижилі кластери клітин регенерували. Вироблені рослини відбирали далі в культуральному розчині, що містить 20 мг/л гігроміцину з 16-годинним періодом фотографії при 26 ° C протягом 4 тижнів, а потім переносили в теплицю і вирощували з рослинами WT під природним сонячним світлом.

Геномну ДНК готували з білафос-стійких рослин методом цетилтриметиламмонійброміду (CTAB) і використовували як зразок для полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) та аналізу саунд-блот. Наявність введеного гена в регенерованих рослинах було перевірено за допомогою ПЛР із використанням праймерів Hygromycin F/R. Загалом 100 мкг ДНК на зразок перетравлювали протягом ночі ферментом рестрикції EcoRI при 37 ° C. Переварену ДНК фракціонували в 1% (мас./Об.) Гелів TAE-агарози, а потім переносили на нейлонову мембрану Hybond-N (Amersham, Arlington Heights, IL, США), відповідно до інструкцій виробника. Часткову послідовність гена Гігроміцину виділяли з плазміди та мітили за допомогою набору для прямого маркування AlkPhos (Amersham) для виготовлення зондів для гібридизації. Потім фрагменти ДНК на нейлоновій мембрані Hybond-N гібридизували із зондом Гігроміцин.

Загальну РНК виділяли з ПЛР-позитивних рослин та ВТ, використовуючи реагент TRIzol (Invitrogen, США). КДНК першої нитки синтезували з 2 мкг загальної РНК за допомогою набору синтетичних кДНК RevertAidTM First Strand (Fermentas, LTU), дотримуючись інструкцій виробника. Ланцюгову реакцію полімеразної зворотної транскрипції (RT-PCR) проводили з використанням праймерів Hygromycin F/R та Actin150 F/R.

Трансгенні рослини вирощували на трансгенному дослідному полі. І стабільно успадковані трансгенні рослини, що мають дві копії трансгену, були відібрані та використані в цьому дослідженні.

Секвенування РНК та аналіз транскриптома

На основі інформації про місцезнаходження відображених карт, рівні експресії генів були розраховані за допомогою компонентів запонки та запонки, використовуючи фрагменти на кілобазу транскрипту на мільйон відображених фрагментів (FPKM) як індекс вимірювання. Відповідно до скринінгового стандарту складчастості (FC) ≥2 та коефіцієнта помилкового виявлення (FDR) Аналіз фенотипу рослин. (A) Рослинна архітектура дикої рослини MH86 та OE: трансгенна рослина OsSPL14. (Б) Морфологічний характер листя. (C) Довжина прапорця. (D) Ширина прапорця. (E) Кількість фрез. (F) Діаметр передозрілого міжвузля. (G) Товщина стінки міжвузля антепенультимата. (H) Висота рослини. (I) Хлорофіл a, Хлорофіл b та вміст каротиноїдів у листку на стадії посіву. (J) Хлорофіл a, хлорофіл b та вміст каротиноїдів у прапоровому листі на стадії зрілості. Планка = 5 см. (* P≤0,05, ** P≤0,01, *** P≤0,001).