Функціональні химери p53, що містять повтор Глі-Ала вірусу Епштейна – Барра, захищені від Mdm2-

Відредаговано Пітером М. Хоулі, Гарвардська медична школа, Бостон, Массачусетс, та затверджено 16 листопада 2001 р. (Отримано для огляду 18 червня 2001 р.)

функціональні

Анотація

Функціональна інактивація білка-супресора пухлини p53 прискореним убіквітин/протеасомним залежним протеолізом є поширеною подією при прогресуванні пухлини. Протеасомна деградація гальмується повторенням Глі-Ала (GAr) ядерного антигену-1 вірусу Епштейна – Барра, який діє як передавальний елемент на різних протеасомних субстратах. Ми демонструємо, що химери p53, що містять домени GAr різної довжини та положення всередині білка, захищені від протеолізу, індукованого убигітиновими лігазами мишачого подвійного хвилини 2 та білком, асоційованим з E6, але все ще убіквітіновані та зберігають здатність взаємодіяти з убіквітин-зв'язуючим S5a субодиниця протеасоми. Химери GAr трансактивують гени-мішені р53, індукують зупинку клітинного циклу та апоптоз і демонструють поліпшену активність пригнічення росту в пухлинних клітинах з порушеною ендогенною активністю р53.

Інактивація p53 високим рівнем Mdm2 або HPV E6 забезпечує очевидну перевагу росту in vivo (13, 14), припускаючи, що терапевтично активний білок p53 повинен протистояти активності цих лігаз. У цьому контексті слід підкреслити, що Mdm2 та E6-AP належать до окремих сімейств лібізатів убиквітину (15). Нещодавно було показано, що Mdm2 являє собою убиквітин-лігазу з кільцем, що зв'язується з транскрипційним доменом трансактивації p53 (16). На відміну від цього, E6-AP взаємодіє з ДНК-зв'язуючим доменом і є класичним прикладом убиквітин-лігази домену HECT (гомологія до кінця E6-AP C) (6). Ці явні відмінності між двома лігазами означають, що одночасне врятування p53 від опосередкованої Е6 та Mdm2 деградації може бути досягнуто лише шляхом націлювання на загальні подальші події на шляху деградації.

Цікаву можливість досягти цієї мети може запропонувати нещодавно відкритий модулятор убиквітин-залежного протеолізу, повтор Gly-Ala (GAr) ядерного антигену-1 вірусу Епштейна-Барра (EBV) (EBNA1). Цей білковий домен перешкоджає протеасомній обробці EBNA1 (17), подовжуючи період його напіввиведення та скасовуючи представлення епітопів EBNA1 до основних комплексів гістосумісності класу I-обмежених CD8 + Т-лімфоцитів (18, 19). GAr діє як цис-діючий передавальний елемент на різних протеасомних підкладках (17, 20). Проміскуйність ефекту означає, що GAr може бути в змозі протидіяти активності широкого спектру лібіоз убиквітину, забезпечуючи тим самим привабливий інструмент для регулювання протеолізу багатьох субстратів, що становлять потенційний інтерес для генно-трансферної терапії (21).

Тут ми повідомляємо про генерацію набору химер p53-GAr, які демонструють поліпшену стійкість до індукованої Mdm2- та E6 деградації в аналізах котрансфекції та в клітинних лініях людських пухлин із прискореним протеолізом ендогенного p53. Химери p53-GAr ефективно врятовуються від залежності від убихитину/протеасоми деградації, що призводить до підвищення рівня стійкого функціонально активного p53.

Матеріали і методи

Побудова химер p53-GAr.

Аналіз культури тканин, трансфекції та формування колоній.

Лінії остеосаркоми людини Saos-2 [p53 null (26),] та U2OS [p53 дикого типу, надмірна експресія Mdm2 (13)], а також лінії раку шийки матки людини HeLa (p53 дикого типу, HPV18 позитивні), CasKi та SiHa [p53 дикого типу, позитивні до HPV16 (14, 27)] підтримувались у модифікованому середовищем Дульбекко Іскове (Life Technologies, Grand Island, NY), доповненому 10% FCS. Перехідні трансфекції субконфлюентних моношарів проводили за допомогою ліпофектаміну (Life Technologies). Для аналізів формування колоній 1,9 105 трансфікованих клітин U2OS розщеплювали через 16 год після трансфекції (8000 клітин на лунку) у середовищі, що містить 0,5 мг/мл генетицину (Sigma). Кількість життєздатних колоній підраховували через 2 тижні відбору.

Вестерн-блот-аналіз.

Загальні клітинні екстракти фракціонували за допомогою SDS/PAGE, переносили на нітроцелюлозні мембрани Protran BA85 (Schleicher & Schuell) і зондували первинними моноклональними антитілами миші anti-p53 (D07, Dako) або моноклональними антитілами миші p21 WAF/CIP1 (Transduction Laboratories), Лексінгтон, Кентуккі). Після інкубації з відповідними кон’югованими з пероксидазою вторинними антитілами комплекси візуалізувались за допомогою посиленої хемілюмінесценції (Amersham Pharmacia – Pharmacia Biotech). Для визначення оборотності білка клітини, що швидко переходять, інкубували з циклогексимідом (Sigma). Денситометрію проводили за допомогою персонального денситометра SI (Молекулярна динаміка).

Проточна цитометрія та імуноцитохімія.

Проточний цитометричний аналіз проводили за допомогою проточного цитометра FACSort (Becton Dickinson) та програмного забезпечення Cellquest. Для аналізу клітинного циклу клітини фіксували та фарбували мишачим анти-p53 антитілом D07 та міченим FITC анти-мишачим антитілом (Dako) за допомогою набору Cytofix/Cytoperm (PharMingen) перед інкубацією з йодидом пропідуму (Sigma). Для фарбування за допомогою імунофлюоресценції клітини фіксували в 4% параформальдегіді, а потім інкубували протягом ночі з моноклональним антитілом миші anti-FLAG (M5, Sigma).

Аналізи зниження глутатіон-S-трансферази (GST).

ORF S5a та S8 ампліфікували ПЛР з бібліотеки кДНК людських лейкоцитів (CLONTECH) та клонували у pGEX-5X-1 (Amersham Pharmacia – Pharmacia Biotech). Злиті білки GST-S5a та S8 очищали від штаму Escherichia coli BL-21 (Amersham Pharmacia – Pharmacia Biotech). Клітини HeLa, тимчасово трансфіковані FLAG p53 або FLAG p53-GA239/C, лізували при 4 ° C протягом 12 год у буфері для лізису (1% дигітоніну/50 мМ NaCl/50 мМ Tris, pH 7,6), що містить суміш інгібіторів протеази (Sigma) та 20 мМ N-етилмалеїміду (Sigma). Лізати очищали центрифугуванням протягом 20 хв при 4 ° C, 15000 × g і розбавляли в зв'язуючому буфері (50 мМ Tris, рН 7,6/50 мМ NaCL/0,01% Triton X-100/10% гліцерину). Два мікрограми злитого білка GST іммобілізували на 10 мкл гелю глутатіон Сефароза 4В (Amersham Pharmacia – Pharmacia Biotech) та інкубували з лізатами клітин HeLa. Після п’ятикратного промивання при 4 ° С в буфері для зв’язку зразки ресуспендували в буфері зразків SDS для поділу за допомогою SDS/PAGE та імуноблотування антитілом проти p53 D07.

Результати

Вираз химер p53-GAr.

Був побудований набір химер, що містять GAr, для дослідження впливу повторення на оборот і функцію білка-супресора пухлини p53. GAr довжиною 239 аа, отриманий із природного ізоляту EBV (28), був вставлений у кінцеву точку p53 (рис. 1А). Крім того, на N або C кінці p53 було введено коротший 25-аа-довгий GAr або контрольний 25-аа-відрізок гліцину.

Експресія химер p53-GAr у p53-негативних клітинах Saos-2. (A) Схематичне зображення химер, позначених FLAG (F) p53, що містять N- або C-кінцеві вставки GAr або GGr. (B) Екстракти транзиторно трансфікованих клітин Saos-2 досліджували методом Вестерн-блоттінгу моноклональним антитілом, специфічним для дикого типу p53. Позначені маркери молекулярної ваги.