Гіпотрофія матері впливає на морфологію плаценти та транспорт
Анотація
Вступ
Плацента є активним учасником вагітності, виконуючи функції провідника між матір'ю та плодом. У цій якості він може сприяти зростанню плода за допомогою передачі поживних речовин та кисню 1–3 та мінімізувати несприятливий вплив від потрапляння до плоду через викидні транспортери та інші бар’єрні системи 4. Коли його функція оптимальна, плацента може адаптуватися до змін у середовищі вагітності та захищати плід від несприятливого впливу 1,5. Але якщо здатність плаценти реагувати на подразники навколишнього середовища порушена, можливо, через змінений розвиток та/або функцію плаценти, адаптація може бути недостатньою або відсутнім, а ріст та розвиток плода можуть негативно позначитися на 1,5. Поганий ріст плода є проблематичним: він пов'язаний з неоптимальними траєкторіями росту в ранньому віці та підвищеним ризиком хронічних захворювань у довгостроковій перспективі 6,7. Проте залишається незрозумілим, як плацента адаптується до змінених умов вагітності таким чином, що може сформувати ріст плода і, можливо, лежить в основі раннього походження пізнішої хвороби.
Не всі плоди, що перебувають у несприятливих умовах внутрішньоутробного розвитку, мають ознаки порушеного росту, що може пояснюватися адаптаційною здатністю плаценти, що впливає на її здатність діяти як селективний бар’єр для трофічних факторів та інших ксенобіотиків. Ми висунули гіпотезу про те, що плацента може по-різному адаптуватися до материнської дієти ООН та СН через зміни у її розвитку та функціях, і ці адаптації пояснюватимуть, чому потомство матерів ООН та СН високо зростає внутрішньоутробно, та могли виявити механізми, що лежать в основі розвитку пізніших захворювань . Щоб вирішити цю проблему, ми оцінили вибрані маркери розвитку плаценти, а також АВС і транспортери жирних кислот в кінці вагітності у дам, які харчувались нормальним раціоном ООН або годували високочастотною дієтою, та визначали вплив цих дієт на материнський метаболізм та ріст плоду.
Методи
Тварина модель
Збір та обробка біозразків
На GD18.5, період пікового росту плода і лише після досягнення пікового об'єму плаценти, материнського простору крові та розвитку капілярів плода 51, дамби були вбиті дислокацією шийки матки. Відразу після цього вимірювали глюкозу в хвості за допомогою комерційного глюкометра (Roche Accucheck). Дамби обезголовили, а кров стовбура збирали в пробірки, покриті гепарином, для виділення плазми. Плоди та плаценти швидко видаляли з матки та зважували, а тканини миттєво заморожували у рідкому азоті та зберігали при -80 ° С для подальших молекулярних аналізів, або промивали крижаним 1X PBS, потім фіксували у 10% нейтралізованому формаліном, з подальшим зберіганням у 70% EtOH при 4 ° C перед введенням у парафін для подальших гістологічних аналізів.
Гістологічні аналізи
Плацентарні зрізи, вбудовані у парафін на 5 мкм, фарбували відповідно до стандартних протоколів гематоксиліном та еозином Y (H&E), періодичною кислотою – Шиффом (PAS) або специфічними первинними та вторинними антитілами, як описано нижче. Слайди, зафарбовані H&E та PAS, були скановані цифровим способом із збільшенням у 5 або 20 разів відповідно за допомогою цифрового сканера слайдів Hamamatsu у Центрі оптичного зображення Луненфельда-Таненбаума. Отримані зображення переглядалися за допомогою плагінів ImageJ та ImageJ NDPITools 52. Міри плацентарних ділянок стику та зони лабіринту розраховували, як описано Bloise et al. 53 (2012). PAS-позитивні клітини підраховували у всьому плацентарному відділі і виражали як кількість PAS-позитивних клітин/область спонгіотрофобласту або/зона JZ. Підрахунок площі плаценти та аналіз зображення проводили на одній чоловічій та одній жіночій плацентах з кожної дієтичної групи, де кожна вибрана проба представляла середню масу плода та плаценти для цієї дієтичної групи 53,54. Один спостерігач, засліплений експериментальними групами, проводив аналіз зображення.
Плаценти фарбували для P-gp (1: 500, D-11 Санта-Крус, Міссісога, Канада) та BCRP (1: 200, Кальбіохем, Етобікок, Онтаріо, Канада), як описано вище із наступними змінами: зрізи гасили за допомогою 0,03 % перекису водню в 1X PBS протягом 30 хвилин при кімнатній температурі; вторинним антитілом було біотинільоване антитіло миші козла (1: 200, Vector Labs); і час інкубації субстрату пероксидази DAB для візуалізації сигналів антитіл становив 30 секунд як для P-gp, так і для BCRP. З забруднених зрізів було випадковим чином зафіксовано шість зображень зі збільшенням у 20 разів (інвертований мікроскоп Leica DMIL LED та програмне забезпечення QCapture Pro) у спонгіотрофобласті та в зонах лабіринту. Напівкількісний аналіз для оцінки інтенсивності фарбування на кожному зображенні проводився одним спостерігачем, засліпленим для експериментальних груп, як описано раніше 55. Фарбування було оцінено як відсутні (0), слабке (1), помірне (2), сильне (3) та дуже сильне (4). Розраховували середню інтенсивність фарбування на шести зображеннях для кожної плацентарної зони для кожної плаценти.
гібридизація in situ
Архітектуру плаценти в GD18.5 аналізували за допомогою програмної програми Visiopharm NewCAST (Горсхолм, Данія) після гібридизації in situ з використанням таких зондів: Ctsq, Prl3b1, Pcdh12 і Tpbpa, як описано раніше 19. 20% площі на плацентарний зріз було випадково підраховано при 20-кратному збільшенні (за допомогою мікроскопа Olympus BX61) з 20 точками на поле зору, що становить 8,9 мм 2 на точку/відлік. Всього було проаналізовано 3 або 4 зрізи на плаценту з 4 жіночих та 4 чоловічих плацент на дієтичну групу. Загальну або відносну площу для конкретних структур розраховували для кожного зрізу та усереднювали для плаценти. Структури, що представляють інтерес, включали клітини глікогену, PAS-позитивні клітини, синусоїдальні TGC, TGC, інтерстиціальні клітини глікогену, простір крові матері, простір крові плода, простір крові матері в JZ, лабіринтний трофобласт та область спонгіотрофобластів. Розмір JZ розраховували шляхом підсумовування областей спонгіотрофобласту, TGC та синусів JZ. Розмір LZ розраховували шляхом підсумовування площі крові плода, лабіринтного синуса та ділянок трофобласта лабіринту.
Вимірювання біомаркерів плазми
Для вимірювання біомаркерів у материнському кровообігу згідно з інструкціями виробника використовувались комерційно доступні аналізи на мишах. Плазмовий інсулін (ультрачутливий мишачий ІФА, ALPCO, Салем, NH, США), лептин (мишачий ІФА, Crystal Chem, Downers Grove, Іллінойс, США), адипонектин (ІФА мишачої високої молекулярної маси, ALPCO, Салем, NH, США) та тригліцериди (LabAssay Triglyceride Kit, Wako, Richmond, VA, USA) вимірювали у плазмі. Вільні жирні кислоти (Набір для вимірювання кількості вільних жирних кислот, Sigma-Aldrich, Сент-Луїс, Міссурі, США) вимірювали в материнських еритроцитах, об’єднаних для кожної дієтичної групи, через малий обсяг еритроцитів, доступних від кожної тварини, що унеможливлює індивідуальні заходи тварин.
Виділення та експресія мРНК у плаценті
Загальну РНК екстрагували з плаценти 29, використовуючи реагент TRIZOL (Invitrogen), дотримуючись інструкцій виробника. Чистоту та концентрацію РНК оцінювали за допомогою спектрофотометричного аналізу (Nanodrop), а цілісність РНК перевіряли за допомогою гель-електрофорезу. 1 мкг РНК транскрибували зворотним шляхом із використанням 5X iScript Supermix зворотної транскрипції (BioRad, Міссісога, Онтаріо, Канада). Зразок з нереверсною транскрипцією (NRT; відсутність ферменту) транскрибували зворотним шляхом, щоб забезпечити негативний контроль реакції RT у додатках ПЛР нижче.