Голодування стимулює біосинтез 2-AG в тонкій кишці роль холінергічних шляхів
Микола В. ДіПатріціо
1 Відділ біомедичних наук, Каліфорнійський університет, Ріверсайд, Медичний факультет, Ріверсайд, Каліфорнія;
2 Кафедра анатомії та нейробіології Каліфорнійського університету, Ірвін, Медична школа, Ірвін, Каліфорнія;
Мікі Ігараші
2 Кафедра анатомії та нейробіології Каліфорнійського університету, Ірвін, Медична школа, Ірвін, Каліфорнія;
Від'я Нараянасвамі
2 Кафедра анатомії та нейробіології Каліфорнійського університету, Ірвін, Медична школа, Ірвін, Каліфорнія;
Конор Мюррей
2 Кафедра анатомії та нейробіології Каліфорнійського університету, Ірвін, Медична школа, Ірвін, Каліфорнія;
Джозеф Ганкайко
2 Кафедра анатомії та нейробіології Каліфорнійського університету, Ірвін, Медична школа, Ірвін, Каліфорнія;
Емі Рассел
2 Кафедра анатомії та нейробіології Каліфорнійського університету, Ірвін, Медична школа, Ірвін, Каліфорнія;
Кван-Мук Юнг
2 Кафедра анатомії та нейробіології Каліфорнійського університету, Ірвін, Медична школа, Ірвін, Каліфорнія;
Даніеле Піомеллі
2 Кафедра анатомії та нейробіології Каліфорнійського університету, Ірвін, Медична школа, Ірвін, Каліфорнія;
3 Кафедра фармакології Каліфорнійського університету, Ірвін, Медичний факультет, Ірвін, Каліфорнія;
4 Кафедра біологічної хімії Каліфорнійського університету, Ірвін, Медичний факультет, Ірвін, Каліфорнія; і
5 Відкриття та розробка лікарських засобів, Istituto Italiano di Tecnologia, Генуя, Італія
Анотація
парасимпатичний та симпатичний відділи вегетативної нервової системи важливим чином сприяють регуляції енергетичного балансу (5). Дослідження на мишах показали, що активація центральних рецепторів меланокортину-4, які зменшують годування і є критично важливою для підтримання енергетичного обміну (53), інгібує холінергічні парасимпатичні прегангліонарні нейрони в дорсальному руховому ядрі блукаючого середовища (DMV) і активує симпатичні прегангліонарні нейрони в спинному мозку (44). Докази свідчать, що холінергічні сигнали з еферентного блукаючого нерва контролюють периферійні механізми сигналізації кишечника та мозку, які регулюють харчування. Наприклад, введення периферично обмеженого мускаринового ацетилхолінового рецептора (mAchR) антагоніста атропіну метил нітрату пригнічує годування після швидкого (33), а також підставне споживання рідкої дієти у щурів (25). Можлива інтерпретація цих результатів полягає в тому, що периферичні mAchR беруть участь у контролі споживання їжі, але механізми, за допомогою яких така регуляція може відбуватися, залишаються невідомими.
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ
Тварини
Дорослих самців щурів Спраг-Доулі (250–300 г) купували у Чарльз-Рівер (Вілмінгтон, Массачусетс) і розміщували при кімнатній температурі (22 ° С) у підвісних клітках із дротяним дном, щоб запобігти копрофагії під час експериментів з позбавленням їжі. Тварини утримувались на 12: 12-годинному циклі світло-темно (світло світилося о 06:30 та вимикалося о 1830) і мали вільний доступ до води та стандартних гранул чау-гризу (Harlan Teklad 2020, Північна Америка), за винятком випадків, коли відзначали під час позбавлення їжі експерименти (всім надано вільний доступ до води). Всі експерименти розпочались о 0900. Всі процедури відповідали рекомендаціям Національного інституту охорони здоров’я щодо догляду та використання лабораторних тварин і були схвалені Інституційним комітетом з догляду та використання тварин Каліфорнійського університету, Ірвін.
Хімічні речовини та графік введення
Харчові ефекти інгібування кишкових м3 mAchR і CB1R
Всі тварини (n = 10) отримували обробку носієм (тобто внутрішньодуодельний сольовий розчин по 1 мл та внутрішньоочеревинний ДМСО при 0,5 мл/кг за 20 хв до повторного годування після 24-годинного голодування) у перший день тестування та в останній день тестування . Середні значення для прийому за 1 год повторної подачі після кожної обробки носієм, які статистично не відрізнялись (25,1 ± 1,6 та 22,3 ± 1,9 г/кг маси тіла; t-тест Стьюдента, двосторонній P = 0,28), були усереднені для статистичних порівняння проти медикаментозного лікування. Потім тварин поділяли на дві підгрупи (n = 5/група): підгрупа A отримувала DAU5884 (100 нмоль в/в) та AM6545 (10 мг/кг в/в), а підгрупа B - DAU5884 (100 нмоль в/в) та внутрішньочеревно DMSO-носій. На наступний день тестування підгрупа А отримала DAU5884 (300 нмоль ідентифікатора) та внутрішньоочеревинний DMSO-носій, а підгрупа B отримала DAU5884 (300 нмоль ідентифікатора) та AM6545 (10 мг/кг внутрішньовенно). В останній день медикаментозного лікування всі тварини отримували внутрішньодуоденальний сольовий розчин та внутрішньочеревно AM6545 (10 мг/кг внутрішньовенно).
Інтрадуоденальна інфузія макроелементів
Щурів позбавляли їжі протягом 24 год, а потім вводили зі швидкістю 0,5 мл/хв протягом 10 хв у дванадцятипалу кишку за допомогою носія (стерильний фізіологічний розчин) або рівнокалорійних (загальна кількість 10 ккал) концентрацій інтраліпіду, сахарози або пептону. . Тканини збирали (див. “Обробка тканин”) через 30 хв після початку інфузій.
Операції
Інтрадуоденальні катетери.
Піддіафрагмальна ваготомія.
Усі щури були підготовлені до операції, як зазначено вище (див. Інтрадуоденальний катетер). Шлунок і селезінку обережно втягували, а дорсальний і вентральний відділи блукаючого нерва під діафрагмою ізолювали дрібними щипцями і відшаровували від стравоходу. Два шви наклали на 1,5 см один від одного на кожному відділі блукаючого (загалом чотири шви), а всю нервову тканину між кожним набором швів виділили та видалили за допомогою тонких ножиць. На контрольних підставних хірургічних операціях тварини проходили ті самі процедури, що описані вище, за винятком того, що блукаючий нерв не маніпулював і залишався цілим. М'язова стінка живота була закрита, як зазначено вище (див. Інтрадуоденальний катетер). Тестування розпочали після 7–10 днів відновлення після операції.
Обробка тканин
Екстракції ліпідів.
Всім тваринам знеболювали ізофлураном під час збору тканини, а потім тонку кишку або інші органи швидко видаляли і промивали PBS і заморожували в рідині N2. До швидкого заморожування слизову оболонку товстої кишки відокремлювали від серози шляхом вишкрібання предметним склом. Потім усі тканини зберігали при -80 ° C до часу обробки. Заморожені тканини зважували та гомогенізували в 1,0 мл метанолу, що містить такі внутрішні стандарти: [2 H8] -2-AG (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI) та динонадекадієноїн (Nu-Chek Prep, Elysian, MN). Ліпіди екстрагували хлороформом (2 об.) І промивали водою (1 об.). Органічні фази збирали та фракціонували за допомогою хроматографії на колонці з силікагелем з відкритим шаром, як описано раніше (3). Елюйовані фракції сушили під N2 і відновлювали в 0,1 мл хлороформу: метанолу (1: 3) для рідинної хроматографії/мас-спектрометрії (LC/MS).