Границі Флувоксамін, ослаблений ендоплазматичний ретикулум Стрес-індукована лептинова стійкість

Клітинна ендокринологія

ендоплазматичний

  • Завантажити статтю
    • Завантажте PDF
    • ReadCube
    • XML (NLM)
    • Додаткові
      Матеріал
  • Експортне посилання
    • EndNote
    • Довідковий менеджер
    • Простий текстовий файл
    • BibTex
ПОДІЛИТИСЯ НА

СТАТТЯ Оригінального дослідження

  • Кафедра фармакотерапії, Вища школа біомедичних наук, Університет Хіросіми, Мінамі-ку, Хіросіма, Японія

Все більше доказів вказує на те, що стрес ендоплазматичної сітки (стрес ER) бере участь у розвитку метаболічного синдрому. Однак фармакологічні методи лікування, спрямовані на стресовий стан, недостатньо зрозумілі. У цьому дослідженні ми виявили, що флувоксамін, селективний інгібітор зворотного захоплення серотоніну, що застосовується при депресії, може послабити індуковану стресом ER “стійкість до лептину”, тобто нечутливість до гормону лептину проти ожиріння. Лікування тунікаміцином, реагентом, що викликає стрес, спричинило загибель клітин, що суттєво пригнічувалося флувоксаміном. Лептин активує передачу сигналів JAK2 – STAT3. Стрес ER викликав порушення фосфорилювання STAT3, спричиненого лептином, яке було скасовано флувоксаміном. Флувоксамін був би новим чутливим до лептину лікарським засобом, який орієнтується на стресовий стан.

Вступ

Матеріали і методи

Матеріали та реагенти

Тунікаміцин отримували від компанії Wako Pure Chemical Industries, Ltd. (Японія). Лептин і флувоксамін були отримані від SIGMA (Сент-Луїс, Міссурі, США).

Культура клітин

Клітини людської нейробластоми SH-SY5Y підтримувались у модифікованому середовищі Орла Дульбекко, доповненому 10% (об/об) інактивованою тепловою сироваткою плоду теляти при 37 ° С у зволоженому 5% СО2 та 95% повітрі.

Генерація клітин, трансфікованих рецептором лептину Ob – Rb

Конструкція людського рецептора лептину Ob – Rb, подарунок від Genentech Inc., була трансфікована в клітину SH-SY5Y та HEK293 з використанням реагенту Lipofectamine Plus (Life Technologies Inc.) відповідно до інструкцій виробника. Стабільні трансфектанти (клітини SH-SY5Y – Ob – Rb та HEK293 – Ob – Rb) отримували шляхом відбору з антибіотиком G418 (Hosoi et al., 2006).

Вестерн-блот-аналіз

Вестерн-блот проводили, як описано раніше (Hosoi et al., 2010a, b). Клітини промивали крижаним PBS і лізували в буфері, що містив 10 мМ HEPES – NaOH (рН 7,5), 150 мМ NaCl, 1 мМ EGTA, 1 мМ Na3VO4, 10 мМ NaF, 10 мкг/мл апротиніну, 10 мкг/мл лейпептину, 1 мМ фенілметилсульфонілфториду (PMSF) та 1% NP-40 протягом 20 хв. Лізат центрифугували при 15000 об/хв протягом 20 хв при 4 ° С і збирали супернатант. Зразки кип'ятять буфером Леммлі протягом 3 хв, фракціонують електрофорезом додецилсульфат натрію-поліакриламіду в гелі (SDS-PAGE) і переносять при 4 ° C в нітроцелюлозні мембрани. Мембрани інкубували з антифосфо STAT3 (Tyr705: сигналізація клітин; 1: 1000), анти STAT3 (Санта-Крус; 1: 1000), анти-KDEL (StressGen; 1: 1000) та анти-PARP (Санта-Крус; розведені до 1: 1000) антитіла з наступним антитілом до пероксидази, пов’язаним з хроном. Пероксидазу виявляли хемілюмінесценцією з використанням вдосконаленої системи хемілюмінесценції.