HBXIP та LSD1, зчеплені lncRNA Hotair, опосередковують транскрипційну активацію раком c-Myc

Знайдіть цього автора на Google Scholar
Знайдіть цього автора на PubMed
Шукайте цього автора на цьому сайті
Для листування: yelihong @ nankai.edu.cnzhangxd @ nankai.edu.cn

Анотація

Вступ

Ракові клітини характеризуються набуттям кількох характеристик, що дозволяють їм перетворитися на пухлинні, в яких неконтрольована проліферація є однією з найбільш фундаментальних характеристик ракових клітин (1, 2). Активація онкогенів та їх кооперативні ефекти відіграють вирішальну роль у процесі туморогенезу та проліферації клітин. Опосередковане онкогеном перепрограмування експресії генів, яке дозволяє клітині набути порушення метаболізму, клітинного циклу та інших аспектів, є ознакою ракових клітин (1, 3, 4). Важливо, що прото-онкоген c-Myc, який був залучений до патогенезу більшості типів пухлин людини (1, 5), впливає на безліч клітинних біологічних процесів, включаючи клітинний цикл, синтез білка, адгезію клітин, цитоскелет, метаболізм та регуляція мікроРНК (6–8). Білок c-Myc зв'язується з послідовністю ДНК, яка називається E-box (CACGTG), і димеризується з Максом для посередницького наближення до загальної кількості 3000 - 4000 генів людини (9, 10). білок c-Myc містить основний ДНК-зв'язуючий домен та мотив димеризації спіралі-спіралі-лейцинової блискавки (HLH-Zip), за допомогою якого інші фактори транскрипції та коактиватори можуть впливати на експресію цільових генів c-Myc (11, 12). Однак основний механізм транскрипційної регуляції генів-мішеней c-Myc залишається нерозгаданою таємницею.

Х-взаємодіючий білок гепатиту В Х (HBXIP), також відомий як LAMTOR5 (13), є білком 18 кДа, який містить лейцинову блискавку на своєму С-кінці, і його послідовність добре зберігається серед видів ссавців (14). Ми повідомляли, що експресія HBXIP, очевидно, збагачується в тканинах раку молочної залози. HBXIP діє як онкогенний транскрипційний коактиватор багатьох факторів транскрипції, таких як TF-IID, STAT3, SP1, CREB та E2F1, у стимулюванні росту та метастазування раку молочної залози (15–20). Однак, чи служить HBXIP коактиватором онкогенного транскрипційного фактора c-Myc при раку молочної залози, залишається недостатньо вивченим.

Враховуючи, що транскрипційна активація пов’язана із середовищем хроматину, модифікація гістону H3 є основною закономірністю ремоделювання хроматину (21). Опосередковане лізином деметилаза 1 (LSD1) деметилювання H3K4 призводить до місцевого окислення ДНК як рушійної сили у складі комплексу ініціації транскрипції, спричиненого c-Myc (22, 23). Епігенетика бере участь у транскрипції, опосередкованій c-Myc (24, 25). Довгі некодуючі РНК (lncRNA) з’являються як нові гравці в парадигмі раку, що демонструють потенційну роль як в онкогенному, так і в супресивному пухлинному шляху. Ці нові гени виконують чудові біологічні функції при різних видах раку людини (26). LncRNA HOX-транскрипт антисмислової міжгенної РНК (Hotair), ідентифікована як 2,2-кілобазна ncRNA, що знаходиться в локусі HOXC, може зв'язуватися з LSD1. Hotair служить лісом з комплексів модифікації гістонів, що включають LSD1 та полікомбо-репресивний комплекс 2 (PRC2), що призводить до злоякісних утворень множинних пухлин (27, 28). Повідомлялося, що lncRNA PRNCR1 та PCGEM1 беруть участь у транскрипційному комплексі андроген-рецептор (29). Однак чи брав участь Hotair в активації транскрипції, спричиненої c-Myc, недостатньо документовано.

У цьому дослідженні ми намагаємось отримати уявлення про механізм активації транскрипції, опосередкованої c-Myc. Цікаво, що наші дані показують, що HBXIP, діючи як коактиватор, безпосередньо взаємодіє з фактором транскрипції c-Myc. HBXIP і LSD1 утворюють комплекс, який Hotair встановлює для активації c-Myc в промоторі цільових генів c-Myc, що призводить до активації транскрипції генів-мішеней c-Myc у клітинах раку молочної залози. Таким чином, наш висновок дає нові уявлення про механізм, за допомогою якого c-Myc функціонує в канцерогенезі.

Матеріали і методи

Клітинні лінії, трансфекція та siРНК

Імморталізовані клітинні лінії молочної залози HBL-100 та клітинні лінії раку молочної залози MCF-7, T47D, LM-MCF-7 та SK-BR3 культивували в середовищі RPMI 1640 (Invitrogen) з 10% FCS. Клітини MDA-MB-463, MDA-MB-231 та HEK293T культивували в DMEM (Invitrogen) з додаванням 10% FCS. Раніше повідомлялося про siRNAs, націлені на мРНК HBXIP (16, 19). МіРНК, націлені на мРНК c-Myc, мРНК Hotair та LSD1, були перелічені в додатковій таблиці S1 (28). Клітини трансфікували відповідними плазмідами або siРНК з використанням ліпофектаміну 2000 (Invitrogen) відповідно до інструкцій виробника.

Аналізи імунопреципітації хроматину та перекриття зв'язування HBXIP та c-Myc

Аналізи імунопреципітації хроматину (ChIP) проводили з використанням набору імунопреципітації хроматину EpiQuik від Epigentek Group Inc. Клітини MCF-7 лізували через 24 години після трансфекції. Білкові/ДНК-комплекси імунопреципітували антитілами HBXIP або LSD1, використовуючи нормальний кролячий IgG як негативний контроль. Праймери, використані для ампліфікації ПЛР, фланкували E-box у промоторах цикліну A, eIF4E та LDHA (30–32). Виділення та лігування ChIP-ДНК (ChIP-DSL) та аналіз даних генів, пов'язаних з HBXIP, були проведені CapitalBio Corporation відповідно до протоколу Aviva Systems Biology. Експерименти повторювали три рази, і результати аналізували за допомогою MAS (http://bioinfo.capitalbio.com/mas/login.do) із відсіканням величини P 1,0 × 10 6 для ідентифікації промотору. Згідно з попереднім звітом (33), використовувались набори даних ChIP-seq для c-Myc. Відповідно до номера приєднання та назви гена, 1348 генів, що зв’язані з верхніми зв’язками, у наборах даних c-Myc були використані для злиття з зв’язаними з HBXIP генами для перекриття. Генні шляхи були проаналізовані за допомогою бази даних KEGG в DAVID Bioinformatics Resources 6.7 (http://david.abcc.ncifcrf.gov/).