Індуцибельна синтаза оксиду азоту має різний вплив на судинну та метаболічну функції при ожирінні

Анотація

У цьому дослідженні ми використовували інтегрований підхід in vivo та ex vivo в мишачій моделі ожиріння, спричиненого дієтою, для вивчення механізмів дисфункції ендотелію при ожирінні, зосереджуючи увагу на можливому залученні iNOS. Ми повідомляємо про ряд нових висновків: 1) ожиріння характеризується експресією iNOS у судинній системі; 2) судинна продукція АФК компенсує порушення вазодилатації, опосередкованої ацетилхоліном; 3) миші, у яких відсутня iNOS, захищені від ожиріння, стійкого до зниження глюкози та судинорозширювальних ефектів інсуліну, але все ще мають підвищений артеріальний тиск та порушену релаксацію до ацетилхоліну, що компенсується виробленням АФК.

оксиду

ДИЗАЙН ДИЗАЙН І МЕТОДИ

Самців мишей дикого типу (WT) C57BL/6J виводили в наших лабораторіях. Гомозиготні миші iNOS KO на фоні C57BL/6J були добрим подарунком від доктора А.Дж. Хоббс (Університетський коледж Лондона). Ожиріння було викликане годуванням мишей дієтою з високим вмістом жиру (5286 ккал/кг; Біосерв) після відлучення. Контрольних тварин годували стандартним раціоном. Мишей поселяли у звичайному приміщенні для тварин з 12: 12-годинним циклом світло: темрява. Усі процедури виконувались відповідно до Закону Великобританії щодо експлуатації тварин (про наукові процедури) (1986).

Оцінка метаболічної регуляції, ліпідів у плазмі та нітритів у плазмі.

Після 4 і 8 тижнів годування тести на толерантність до глюкози та інсуліну проводили у мишей, які перебувають у свідомості, шляхом повторних заборів крові після внутрішньочеревної ін’єкції глюкози (1 мг/г) або людського інсуліну (0,75 одиниці/кг), як описано раніше (22). . Глюкозу в крові вимірювали за допомогою портативного приладу (Hemocue, Шеффілд, Великобританія), а рівні інсуліну оцінювали за допомогою специфічного гіперчутливого радіоімуноаналізу (Linco Research, St. Charles, MO). Оцінка гомеостатичної моделі (HOMA) оцінка чутливості до інсуліну була розрахована як інсулін × глюкоза ÷ 22,5. Зразки крові отримували з бічної підшкірної вени, а рівень глюкози вимірювали в цільній крові. Вільні жирні кислоти та тригліцериди вимірювали в плазмі натще, використовуючи колориметричні аналізи (Roche, Mannheim, Germany; ThermoTrace, Victoria, Australia). Нітрит плазми вимірювали за допомогою реакції Грісса (14).

Вимірювання артеріального тиску in vivo.

Систолічний артеріальний тиск вимірювали за допомогою плетизмографії хвостової манжети (22,23) у мишей, що перебувають у свідомості, попередньо підігрітих протягом 10 хв у термостатично регульованому обмежувачі (XBP1000; Kent Scientific). Протягом тижня перед проведенням вимірювань було проведено три навчальних заняття. Середнє значення принаймні шести окремих записів тричі брали для розрахунку середнього систолічного артеріального тиску.

Оцінка ex vivo функції судин.

NO-опосередкована судинна реакція на інсулін оцінювалася шляхом побудови кривих дози-відповідь фенілефрину до та після 2-годинного впливу інсуліну (100 мО/мл). Раніше ми демонстрували на здорових мишах, що інсулін викликає затухання ендотелію пригнічення судинозвужувальної відповіді на фенілефрин і що цей ефект скасовується за допомогою l -NMMA; тобто він не опосередковується NO (23).

Вимірювання на місці судинної продукції активних форм кисню.

Генерування АФК в аорті in situ вимірювали за допомогою флуоресценції дигідроетидію (DHE), як повідомлялося раніше (24, 26). Для вивчення можливості стимулювання вироблення АФК в судинах ацетилхоліном оцінювали флуоресценцію DHE в кільцях аорти, які зазнавали впливу ацетилхоліну або фізіологічного розчину. Інтенсивність флуоресценції на ендотеліальній поверхні визначали мікроскопічно як мінімум із п'яти випадкових полів (1024–1022 пікселів; 269,7 × 269,2 мкм) на слайд та трьох слайдів на експериментальний стан, використовуючи комп’ютеризовану систему аналізу зображень (імпровізація).

Експресія мРНК NOS в аорті.

Загальну РНК витягували з аорт (Міні-волокнистий набір; Квіаген), і рівні кількості транскрибували зворотним шляхом із використанням Суперскрипту II RT (Invitrogen) та випадкових олігонуклеотидів декамеру. Аналізи RT-PCR в реальному часі на експресію мРНК eNOS, nNOS, iNOS та β-актину проводили в двох примірниках із використанням системи виявлення послідовностей ABI Prism 7000 (23). Були використані праймери та позначені FAM зонди, специфічні для цих генів (Assays on-Demand; Applied Biosystems). КДНК ампліфікували за таких умов: 10 хв при 95 ° C, після чого 40 циклів по 15 с при 95 ° C і 1 хв при 60 ° C. Для кількісного визначення використовували стандартний метод кривих (User Bulletin No 2; ABI Systems), а результати експресії β-актину нормалізували.