Індукована ожирінням експресія MBD2_v2 сприяє ініціюванню пухлини потрійного негативного стовбура раку молочної залози

Інструменти

Слідкуйте за журналом

Кафедра онкології, Інститут раку Барбари Ен Карманос, Медична школа Університету Уейна, Детройт, Мічиган, США

Кафедра комп'ютерних наук, Університет штату Уейн, Детройт, Мічиган, США

Листування

А. Болліг-Фішер, Барбара Енн Карманос, Інститут раку, 4100 Джон Р. Сент-Детройт, Мічиган, 48201, США

Кафедра комп'ютерних наук, Університет штату Уейн, Детройт, Мічиган, США

Листування

А. Болліг-Фішер, Барбара Енн Карманос, Інститут раку, 4100 Джон Р. Сент-Детройт, Мічиган, 48201, США

Анотація

Скорочення

1. Вступ

За останні 25 років поширеність ожиріння подвоїлася в 70 країнах, включаючи США, і майже третина дорослих людей у всьому світі зараз страждають від надмірної ваги або ожиріння (Афшин та ін., 2017). Зростаюча пандемія ожиріння викликає занепокоєння, оскільки ожиріння є відомим фактором ризику для цілого ряду хронічних, виснажливих або небезпечних для життя захворювань (ВООЗ, 2000), таких як ревматоїдний артрит, цукровий діабет 2 типу, серцево-судинні захворювання та рак (ВООЗ), 2000). Підгрунтям асоціації ризику між ожирінням та цими захворюваннями є накопичення надлишку жирової тканини, що викликає аберрантну вроджену імунну відповідь, що спричиняє місцеве та системне хронічне запалення, ознаками якого є підвищений рівень прозапальних цитокінів, що призводить до збільшення вироблення вільних радикалів, включаючи реактивні види кисню (АФК) (Crujeiras та ін., 2013; Гривенников та ін., 2010 р .; Роча та Ліббі, 2009; Веллен і Готаміслігіл, 2005).

2 Матеріали та методи

2.1 Тестування на зв'язок між рівнями експресії MBD2_v2 пухлини та результатами пацієнта та індексом маси тіла (ІМТ)

2.2 Клітинні лінії, умови культури та аналіз формування мамосфери

Потрійно-негативні клітинні лінії раку молочної залози MDA ‐ MB ‐ 468 та MDA ‐ MB ‐ 231 були отримані з колекції American Type Culture (ATCC, Манассас, штат Вірджинія, США) і регулярно культивовані в 10% модифікованому середовищі Eagle FBS Dulbecco при 37 ° C., 5% СО2. Клітинна лінія TNBC SUM149, розроблена та придбана у Стівена Етьє (Forozan та ін., 1999), культивували в 5% середовищі FBS HAM F-12, що містило 1 мкг · мл -1 гідрокортизону та 5 мкг · мл -1 інсуліну людини. Ці три клітинні лінії представляють молекулярний підтип TNBC. Клітинні лінії аутентифікували за допомогою короткого тандемного повторного аналізу за допомогою системи PowerPlex (r) 16 від Promega (Медісон, штат Вісконсин, США). Наявність і здатність до самовідновлення CSC аналізували в культурах клітин TNBC, використовуючи аналіз формування мамосфери, як проводили раніше (Бао та ін., 2017), і описаний у Shaw та ін. (2012). Сформовані мамосфери підраховували і повідомляли як частку від загальної кількості засіяних клітин (1000). Зображення були зроблені за допомогою мікроскопа Eclipse TE2000 ‐ U (Nikon, Токіо, Японія). Внутрішньоклітинний аналіз MAK164 (Sigma-Aldrich, Сент-Луїс, Міссурі, США) використовували для вимірювання рівня перекису водню в культивованих клітинах.

2.3 Напівкількісний RT-PCR та імуноблот-аналіз

2.4 Стабільний нокдаун SRSF2 та надмірне вираження MBD2_v2 в клітинних лініях

Лентівірусна опосередкована експресія експресії SRSF2 shRNA виконувалась, як описано раніше, за допомогою лентівірусної системи shRNAmir Gentizentrirus shRNAmir Open Biosystems Expression Arrest (Bollig ‐ Fischer та ін., 2011). Клітини MDA ‐ MB ‐ 468 трансдукувались з векторами, націленими на SRSF2 (кат. No RHS4430‐98485060 та RHS4430‐101104677) або на незвучний контрольний вектор. Стабільну надмірну експресію MBD2_v2 в клітинах MDA ‐ MB ‐ 231 проводили, як описано раніше (Бао та ін., 2017). Запаковані лентівірусні частинки для надмірного вираження MBD2_v2 (NM015832.4) або GFP були придбані у Cyagen Biosciences (Санта-Клара, Каліфорнія, США).

2.5 Робота з тваринами

2.6 Профілювання загальної експресії геном пухлин, отриманих від мишей

2.7 Статистичний аналіз

Статистичний аналіз проводили за допомогою r 3.3.2 (http://www.R-project.org/). Графіки були сформовані за допомогою призми r 3.3.2 або графічної панелі (Graphpad Software, Сан-Дієго, Каліфорнія, США). значення ≤ 0,05 повідомляються як значущі. Уелча т‐Тест застосовували до напівкількісних даних RT-PCR та даних аналізів мамосфери. Тест Грея на різницю в кумулятивній захворюваності був використаний для оцінки значущості відмінностей, що спостерігаються у частоті утворення пухлини миші та часу до подій між експериментальними групами. Точний тест Фішера використовували для оцінки різниці в частоті утворення пухлини на певну дату. Узагальнені найменші квадрати, що дозволяють проводити кореляційні спостереження у однієї і тієї ж тварини, коли це доцільно (тобто двостороння інокуляція), оцінюючи взаємодію між групою та часом, використовували для перевірки, чи різняться темпи росту пухлини у досліджуваних груп. Середню масу тіла мишей розраховували для чотирьох клітин у кожному стані, до 6 мишей на клітку, вимірювали 2–3 рази на тиждень протягом 185 днів. Для моделювання поздовжніх даних була побудована квадратична модель. Відмінності між групами в даний момент часу порівнювали за допомогою лінійного предиктора з моделі та Стьюдента т‐Тест.